巨噬細(xì)胞在肝癌細(xì)胞上皮-間質(zhì)樣表型轉(zhuǎn)化中的作用及其機(jī)制的研究.pdf

1、肝細(xì)胞肝癌(Hepatocellular carcinoma，HCC)(簡(jiǎn)稱肝癌)是全球發(fā)病率和死亡率均較高的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率居第五位，病死率居第三位，在我國(guó)每年新診斷的肝癌約占全世界的55％，其死亡率在我國(guó)惡性腫瘤中位列第二位。雖然近年來(lái)診斷和治療技術(shù)的進(jìn)步使得肝癌患者的生存率有了較大提高，但術(shù)后復(fù)發(fā)與轉(zhuǎn)移已成為影響肝癌預(yù)后的主要因素。臨床上需要探索和闡明肝癌復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制從而準(zhǔn)確預(yù)測(cè)患者預(yù)后、尋找高效的靶點(diǎn)并設(shè)計(jì)合理干預(yù)治

2、療的新方法。
　　 傳統(tǒng)的肝癌研究主要注重于肝癌細(xì)胞自身，探索其內(nèi)在的基因和蛋白變化來(lái)解釋腫瘤的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移。然而，腫瘤是在一定的局部環(huán)境中生長(zhǎng)的，所以局部的微環(huán)境對(duì)于腫瘤的發(fā)生發(fā)展也起著至關(guān)重要的作用。炎癥微環(huán)境作為腫瘤微環(huán)境的重要組成部分，與腫瘤的發(fā)生發(fā)展、復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移都有著密切的關(guān)系。例如乙肝病毒或丙肝病毒感染或諸如嗜酒、肥胖等非感染因素造成的肝臟慢性炎癥及繼發(fā)的肝硬化狀態(tài)就是肝癌發(fā)生發(fā)展的“土壤”。
　　 上皮-間質(zhì)樣

3、表型轉(zhuǎn)化(epithelial mesenchymal transition，EMT)是指在特定的生理和病理情況下，上皮細(xì)胞暫時(shí)喪失極性并表現(xiàn)出具有移行能力的間質(zhì)細(xì)胞的現(xiàn)象，是癌細(xì)胞脫離原發(fā)灶完成轉(zhuǎn)移的重要步驟。目前認(rèn)為腫瘤細(xì)胞發(fā)生EMT是微環(huán)境中作用因子和腫瘤細(xì)胞相互作用的結(jié)果，這導(dǎo)致細(xì)胞通路和基因表達(dá)發(fā)生改變，最終使腫瘤細(xì)胞更富于侵襲性而利于轉(zhuǎn)移。腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞(Tumorassociated macrophage，TAM)存在于

4、腫瘤間質(zhì)中，是腫瘤免疫微環(huán)境中主要的成分，其通過(guò)分泌特殊的細(xì)胞因子、生長(zhǎng)因子等作用于腫瘤相關(guān)基質(zhì)或內(nèi)皮細(xì)胞，參與了促腫瘤發(fā)展、刺激腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移，誘導(dǎo)腫瘤新生血管和淋巴管生成、免疫抑制等過(guò)程。在我所前期研究中發(fā)現(xiàn)，肝癌患者癌旁組織中的巨噬細(xì)胞集落刺激因子(M-CSF)在腫瘤邊緣濃度最高，癌旁組織中M-CSF和巨噬細(xì)胞增多與患者預(yù)后不良相關(guān)；在巨噬細(xì)胞與黑色素瘤的相關(guān)研究中，發(fā)現(xiàn)腫瘤侵襲邊緣的CD68+巨噬細(xì)胞密度與患者預(yù)后負(fù)相關(guān)。這

5、些現(xiàn)象提示可能在腫瘤侵襲邊緣區(qū)域，巨噬細(xì)胞通過(guò)分泌某些細(xì)胞因子增加這些區(qū)域中腫瘤細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力，而促進(jìn)其復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移。
　　 目前，關(guān)于腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞與人肝癌細(xì)胞EMT二者之間的聯(lián)系尚無(wú)相關(guān)研究。本研究通過(guò)體外建立人巨噬細(xì)胞與人肝癌細(xì)胞系共培養(yǎng)系統(tǒng)，系統(tǒng)性地研究巨噬細(xì)胞對(duì)肝癌細(xì)胞發(fā)生EMT的影響及其相關(guān)分子機(jī)制。并通過(guò)抗體芯片的方法篩選可能起相關(guān)作用的細(xì)胞因子，進(jìn)一步通過(guò)組織微陣列技術(shù)，對(duì)肝癌微環(huán)境中相關(guān)炎癥因子的分析，確定

6、主要的細(xì)胞因子，對(duì)可能的細(xì)胞信號(hào)通路進(jìn)行驗(yàn)證，初步闡明在人肝癌組織中巨噬細(xì)胞引發(fā)肝癌細(xì)胞EMT的現(xiàn)象與機(jī)制，為肝癌的發(fā)生發(fā)展和治療提供新的理論支持。
　　 本課題分為三部分：1、人巨噬細(xì)胞對(duì)不同轉(zhuǎn)移潛能人肝癌細(xì)胞系生物學(xué)特性影響的研究；2、巨噬細(xì)胞對(duì)人肝癌細(xì)胞上皮.間質(zhì)樣表型影響的研究；3、巨噬細(xì)胞分泌的IL-8對(duì)人肝癌細(xì)胞上皮-間質(zhì)樣表型影響及相關(guān)機(jī)制的研究。
　　 第一部分人巨噬細(xì)胞對(duì)不同轉(zhuǎn)移潛能人肝癌細(xì)胞系生物學(xué)特

7、性影響的研究
　　 目的：研究人巨噬細(xì)胞對(duì)不同轉(zhuǎn)移潛能人肝癌細(xì)胞系生物學(xué)特性的影響，初步探索巨噬細(xì)胞與人肝癌細(xì)胞系生物學(xué)特性改變的相關(guān)性。
　　 方法：首先將人白血病單核細(xì)胞系THP-1，經(jīng)過(guò)佛波酯刺激后分化成為巨噬細(xì)胞；其次選擇人高轉(zhuǎn)移潛能肝癌細(xì)胞系MHCC-97H，MHCC-97L與人低轉(zhuǎn)移潛能肝癌細(xì)胞系Hep-G2，Huh-7，于六孔板小室中與巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)，觀察其生物學(xué)形態(tài)改變；應(yīng)用細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)共培養(yǎng)體系中肝

8、癌細(xì)胞運(yùn)動(dòng)遷移能力；應(yīng)用Transwell侵襲小室檢測(cè)共培養(yǎng)體系中肝癌細(xì)胞對(duì)的侵襲能力。
　　 結(jié)果：巨噬細(xì)胞與人肝癌細(xì)胞系共培養(yǎng)之后，細(xì)胞形態(tài)發(fā)生顯著改變，運(yùn)動(dòng)遷移能力增強(qiáng)，對(duì)基底層的侵襲能力增強(qiáng)。
　　 結(jié)論：巨噬細(xì)胞可能通過(guò)某些細(xì)胞因子增強(qiáng)人肝癌細(xì)胞系的運(yùn)動(dòng)及遷移侵襲能力。
　　 第二部分巨噬細(xì)胞對(duì)人肝癌細(xì)胞上皮-間質(zhì)樣表型影響的研究
　　 目的：研究巨噬細(xì)胞對(duì)人肝癌細(xì)胞發(fā)生上皮-間質(zhì)樣表型轉(zhuǎn)變的影

9、響，探索二者之間的相關(guān)性及可能發(fā)揮作用的細(xì)胞因子。
　　 方法：隨機(jī)選取30例普通肝癌患者手術(shù)病理石蠟切片，利用免疫雙染的方法觀察巨噬細(xì)胞與肝癌組織中發(fā)生上皮-間質(zhì)樣表型轉(zhuǎn)變的細(xì)胞之間的關(guān)系；將高轉(zhuǎn)移潛能人肝癌細(xì)胞系MHCC-97H、MHCC-97L與低轉(zhuǎn)移潛能人肝癌細(xì)胞系Hep-G2、Huh-7與THP-1誘導(dǎo)分化的巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)；應(yīng)用WesternBlot的方法檢測(cè)上皮-間質(zhì)樣變化的分子標(biāo)志E-Cadherin、N-Cadh

10、erin和Snail的表達(dá)情況；應(yīng)用免疫熒光的方法檢測(cè)E-Cadherin、N-Cadherin和Snail表達(dá)的變化；應(yīng)用抗體芯片的方法檢測(cè)并篩選可能發(fā)揮作用的細(xì)胞因子。
　　 結(jié)果：在人肝癌組織切片中，巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)區(qū)域中肝癌細(xì)胞間質(zhì)樣標(biāo)志物N-Cadherin及Snail的表達(dá)增強(qiáng)：WesternBlot顯示E-Cadherin的表達(dá)隨著肝癌細(xì)胞系轉(zhuǎn)移潛能的增高而減弱，N-Cadherin及Snail的表達(dá)隨著肝癌細(xì)胞系轉(zhuǎn)移

11、潛能的增加而增強(qiáng)；與巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)后，和對(duì)照組相比較，E-Cadherin表達(dá)減弱，而N-Cadherin與Snail表達(dá)增強(qiáng)；免疫熒光顯示共培養(yǎng)組E-Cadherin表達(dá)低于對(duì)照組，N-Cadherin與Snail表達(dá)高于對(duì)照組；抗體芯片提示IL-6與IL-8可能為主要作用的細(xì)胞因子。
　　 結(jié)論：巨噬細(xì)胞可引起人肝癌細(xì)胞發(fā)生上皮-間質(zhì)樣表型的轉(zhuǎn)變，該作用可能與IL-6和IL-8有關(guān)。
　　 第三部分巨噬細(xì)胞分泌的IL

12、-8對(duì)人肝癌細(xì)胞上皮.間質(zhì)樣表型影響及相關(guān)機(jī)制的研究
　　 目的：通過(guò)研究人肝癌組織內(nèi)IL-8與CD68的表達(dá)情況，并分析共培養(yǎng)系統(tǒng)中巨噬細(xì)胞分泌的IL-8的作用，探索其促進(jìn)人肝癌細(xì)胞發(fā)生上皮.間質(zhì)樣表型轉(zhuǎn)變的機(jī)制。
　　 方法：應(yīng)用ELISA法分別檢測(cè)人肝癌細(xì)胞系Hep-G2、人巨噬細(xì)胞及二者共培養(yǎng)體系中培養(yǎng)液上清中IL-8的濃度；應(yīng)用組織芯片和免疫組化的技術(shù)比較IL-8、IL-6及巨噬細(xì)胞表面標(biāo)志物CD68的表達(dá)，分

13、析二者的相關(guān)性；應(yīng)用免疫熒光的方法比較外源性IL-8作用于人肝癌細(xì)胞系Hep-G2后EMT標(biāo)志物E-Cadherin、N-Cadherin及Snail的變化情況；應(yīng)用細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)外源性IL-8對(duì)肝癌細(xì)胞運(yùn)動(dòng)遷移能力的影響；應(yīng)用Transwell侵襲小室檢測(cè)外源性IL-8對(duì)肝癌細(xì)胞侵襲能力的影響；應(yīng)用WesternBlot的方法檢測(cè)外源性IL-8對(duì)肝癌細(xì)胞上皮.間質(zhì)樣表型轉(zhuǎn)化中信號(hào)通路的變化情況；
　　 結(jié)果：人巨噬細(xì)胞及其與

14、人肝癌細(xì)胞系Hep-G2共培養(yǎng)體系中培養(yǎng)液上清中IL-8濃度顯著高于人肝癌細(xì)胞系Hep-G2(P<0.001)；IL-6在人肝癌癌內(nèi)與癌旁組織中均有表達(dá)，其表達(dá)無(wú)個(gè)體與組織特異性，而IL-8與CD68二者在人肝癌癌內(nèi)與癌旁組織中表達(dá)存在正相關(guān)性(P<0.0001)；外源性IL-8可促進(jìn)肝癌細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)遷移能力及侵襲能力：外源性IL-8可以通過(guò)JAK2/S TAT3途徑激活Snail，從而使細(xì)胞發(fā)生上皮.間質(zhì)樣表型轉(zhuǎn)變。
　　 結(jié)論

15、：巨噬細(xì)胞通過(guò)分泌IL-8作用于肝癌細(xì)胞使之發(fā)生上皮-間質(zhì)樣表型轉(zhuǎn)變。
　　 創(chuàng)新點(diǎn)
　　 1.初步探索人巨噬細(xì)胞對(duì)人肝癌細(xì)胞EMT的影響及可能的作用機(jī)制。
　　 2.首次利用抗體芯片在人巨噬細(xì)胞與人肝癌細(xì)胞共培養(yǎng)體系中大量篩檢相關(guān)細(xì)胞因子，初步闡明了IL-8在肝癌細(xì)胞EMT中的作用機(jī)制。
　　 潛在應(yīng)用價(jià)值
　　 1.肝癌組織中巨噬細(xì)胞是一個(gè)潛在的肝癌轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)的治療靶點(diǎn)。
　　 2.為深