己烯雌酚單克隆抗體和酶標(biāo)抗原的研制.pdf

1、己烯雌酚(diethylstibestrol，DES)是一種人工合成的雌激素，在促進(jìn)動(dòng)物蛋白質(zhì)的合成代謝、提高動(dòng)物日增重和減少脂肪等方面效果明顯，因此一直被作為一種動(dòng)物生長(zhǎng)促進(jìn)劑用于畜禽以及水產(chǎn)品養(yǎng)殖中。國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)(IARC)研究發(fā)現(xiàn)，DES是一種致癌物質(zhì)，能夠在動(dòng)物源性食品如肝臟、肌肉、蛋、奶中殘留，并通過食物鏈危害人體健康。因此世界各國(guó)均規(guī)定食品動(dòng)物養(yǎng)殖中不得以任何途徑和方式使用DES，養(yǎng)殖動(dòng)物及動(dòng)物性食品中不得檢出DES。

2、 DES殘留免疫分析是DES應(yīng)用監(jiān)控的一種重要手段，本文通過DES人工抗原的制備和鑒定、抗DES多克隆和單克隆抗體的制備和鑒定、DES酶標(biāo)抗原合成以及酶免疫檢測(cè)DES方法的建立等研究，旨在研制DES酶免疫檢測(cè)試劑盒。 對(duì)己烯雌酚進(jìn)行了結(jié)構(gòu)修飾，用有機(jī)合成方法合成了DES單羧甲基醚，并通過紅外、質(zhì)譜和核磁共振氫譜鑒定合成成功；通過混合酸酐法和碳二亞胺法分別將DES單羧甲基醚與大分子蛋白質(zhì)載體牛血清白蛋白(BSA)和雞卵清蛋白

3、(OVA)偶聯(lián)，合成了四種人工抗原，并通過紫外掃描和SDS-PAGE凝膠電泳鑒定偶聯(lián)成功，其中BSA與DES的偶聯(lián)率約為1∶30，OVA與DES的偶聯(lián)率為1∶18。 用混合酸酐法合成的BSA-DES免疫4只家兔，用混合酸酐法合成的OVA-DES和碳二亞胺法合成的OVA-DES免疫兩組小鼠，獲得了3種抗血清，選用不同的包被原，通過間接ELISA和間接阻斷ELISA法對(duì)3種抗血清進(jìn)行了鑒定，兔血清抗體效價(jià)在1∶10000以上，小鼠血

4、清抗體效價(jià)在1∶8000以上，三種抗血清都能和DES特異性結(jié)合，同時(shí)建立了ELISA檢測(cè)方法。 選用混合酸酐法合成的BSA-DES免疫Balb/c小鼠，用碳二亞胺法合成的OVA-DES做包被檢測(cè)原，間接ELISA檢測(cè)小鼠血清效價(jià)均在1∶1×105以上，選擇其中效價(jià)最高的兩只小鼠脾細(xì)胞，在PEG的作用下與SP2/0瘤細(xì)胞融合，通過間接ELISA法檢測(cè)了單抗雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清中的抗體效價(jià)達(dá)1∶400以上，同時(shí)建立了DES殘留檢測(cè)的酶

5、免疫檢測(cè)方法，其中檢測(cè)限達(dá)0.2μg/Kg。 用碳二亞胺法合成了酶標(biāo)抗原HRP-DES，通過ELISA法證明了HRP-DES的正確合成。同時(shí)，建立了固相抗體競(jìng)爭(zhēng)ELISA法檢測(cè)DES殘留，并繪制了檢測(cè)曲線。 本研究首先將DES衍生成DES單羧甲基醚，通過兩種偶聯(lián)方法和兩種載體合成了四種不同的人工抗原，通過兔子和小鼠的免疫試驗(yàn)，成功制備了高效價(jià)特異性DES抗血清和單克隆抗體，建立了DES殘留檢測(cè)的競(jìng)爭(zhēng)ELISA方法，同時(shí)成