腸道菌群轉(zhuǎn)化篩選銀杏葉提取物防治糖尿病腎病的潛在活性成分.pdf

1、目的：利用液質(zhì)聯(lián)用(Liquid chromatography-tandem mass spectrometry, LC-MS)方法研究銀杏葉提取物(Ginkgo biloba extract, GBE)經(jīng)正常、糖尿病及糖尿病腎病(Diabetic nephropathy, DN)病理狀態(tài)下的大鼠腸道菌群轉(zhuǎn)化后的量變及質(zhì)變規(guī)律，探尋GBE防治DN的潛在生物活性成分。
　　方法：雄性SD大鼠40只，取15只為正常組，其余25只一次性

2、腹腔注射鏈脲佐菌素(streptozotocin，STZ)60 mg/kg誘導(dǎo)糖尿病模型。4周后作為糖尿病組，8周后作為DN組。采用全糞便腸道厭氧菌群體外代謝研究模型，利用LC-MS對(duì)GBE經(jīng)正常及病理狀態(tài)下的腸道菌群轉(zhuǎn)化進(jìn)行定性定量研究。色譜柱:Kromasil-C18色譜柱（4.6×250mm，5μm）;流動(dòng)相:甲醇-0.1％甲酸水溶液，線性梯度洗脫;流速:1.0 mL/min;柱溫:35℃;自動(dòng)進(jìn)樣器溫度:4℃;進(jìn)樣量:10μL。

3、柱后分流比1∶3進(jìn)入質(zhì)譜;ESI源;負(fù)離子模式檢測;干燥氣溫度及流量:350℃，11 L/min;噴霧壓力:20 Psi;毛細(xì)管電壓:3000 v;碎片電壓:110V。定性分析，根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道GBE中化學(xué)成分研究結(jié)果并結(jié)合質(zhì)譜裂解規(guī)律及標(biāo)準(zhǔn)品比對(duì)，建立GBE經(jīng)正常大鼠腸道菌群轉(zhuǎn)化后的化學(xué)成分譜，兼顧糖尿病及DN病理狀態(tài)以尋找其可能存在的特異性成分或代謝產(chǎn)物。定量分析，采用MS的多重反應(yīng)監(jiān)測(Multiple reaction motito

4、ring，MRM)定量模式，借用“DAS2.0”軟件擬合得到GBE中14種成分正常及病理狀態(tài)下的腸道菌群代謝的生物轉(zhuǎn)化參數(shù)，數(shù)據(jù)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件處理，通過分析生物轉(zhuǎn)化參數(shù)結(jié)果及14種物質(zhì)的量變趨勢圖來尋找特異性成分。結(jié)合定性定量分析結(jié)果，初步篩選GBE防治糖尿病及DN的潛在活性物質(zhì)。
　　結(jié)果：在正常、糖尿病及DN大鼠腸道菌群所有時(shí)間的孵育液中發(fā)現(xiàn)了30個(gè)共有原型成分和不同時(shí)間出現(xiàn)及消失的15個(gè)代謝產(chǎn)物，通過和對(duì)照品的二

5、級(jí)碎片譜圖及文獻(xiàn)報(bào)道比對(duì)分析，確定了14個(gè)化學(xué)成分，并推測出12個(gè)原型成分和6個(gè)代謝產(chǎn)物。對(duì)已有對(duì)照品的14種成分進(jìn)行MRM定量研究，得到量變趨勢圖;從“DAS2.0”軟件擬合得到的結(jié)果中可以看出，與正常組比較，在GBE菌群孵育的48 h內(nèi)蘆丁、槲皮苷和楊梅素在糖尿病及DN大鼠腸道菌群轉(zhuǎn)化液中轉(zhuǎn)化速度加快，菌群中滯留時(shí)間減少;4種內(nèi)酯類成分、山奈酚、異鼠李素、芹菜素和芫花素在糖尿病及DN大鼠腸道菌群轉(zhuǎn)化液中轉(zhuǎn)化速度均減慢，菌群中滯留時(shí)間

6、延長;和正常組比較，槲皮素、木犀草素和染料木素在DN大鼠腸道菌群轉(zhuǎn)化48h內(nèi)，累計(jì)量增加，且轉(zhuǎn)化減慢,菌群中滯留時(shí)間延長;這3種化合物在糖尿病大鼠腸道菌群轉(zhuǎn)化液中的轉(zhuǎn)換速度和菌群內(nèi)的滯留時(shí)間與正常組之間無顯著性差異。
　　結(jié)論：糖尿病或DN病理狀態(tài)下的菌群發(fā)生了變化，顯著影響了GBE中各成分的代謝，30個(gè)原型成分及15個(gè)代謝產(chǎn)物均可能為GBE防治糖尿病及DN的潛在活性成分。14個(gè)確定結(jié)構(gòu)的原型成分中，槲皮素、木犀草素及染料木素是G