傳染性法氏囊病病毒核衣殼蛋白VP3單克隆抗體的制備及VP3基因沉默穩(wěn)定細胞系的構(gòu)建.pdf

1、傳染性法氏囊病是由傳染性法氏囊病病毒引起的雞的一種急性高度接觸性免疫抑制性傳染病，目前疫苗免疫是防制該病的唯一途徑。但是近年來由于超強毒株變異毒株的出現(xiàn)，使疫苗免疫的效果大打折扣，給家禽養(yǎng)殖業(yè)帶來極大的經(jīng)濟損失。VP3是傳染性法氏囊病病毒的核衣殼蛋白，是病毒的多功能蛋白，在病毒基因組復(fù)制、病毒粒子裝配、介導(dǎo)抑制宿主先天免疫方面都起著關(guān)鍵作用。
　　為了深入研究VP3在傳染性法氏囊病病毒感染中的作用及其介導(dǎo)的致病機制提供有效的檢測工

2、具及細胞感染模型，本研究首先構(gòu)建了VP3的原核表達載體，進一步在大腸桿菌中表達VP3并純化。以純化的VP3蛋白免疫BALB/c小鼠，并經(jīng)篩選成功獲得2株VP3單克隆抗體，mabVP3-1和mabVP3-2，都能很特異地與傳染性法氏囊病病毒VP3反應(yīng)。腹水效價分別為1∶32000、1∶64000。
　　VP3基因在不同株的傳染性法氏囊病病毒基因序列中高度保守。利用生物信息學(xué)軟件對傳染性法氏囊病病毒不同毒株VP3基因編碼區(qū)保守序列進行

3、分析，設(shè)計并合成一系列shRNAs。首先以mabVP3-1介導(dǎo)的免疫印跡篩選方法在HEK293T細胞中測試這些shRNAs沉默VP3的效果。將其中沉默效果最佳的一條shRNA克隆到pLVX-IRES-Puro慢病毒表達載體上，與病毒包裝輔助質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染HEK293T細胞進行慢病毒的包裝。將包裝好的慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)DF-1細胞，用嘌呤霉素篩選14天后獲得穩(wěn)定表達shRNA的DF-1細胞系，利用免疫印跡和噬斑實驗檢測該穩(wěn)定細胞系對病毒的敏感性。

4、r>　　結(jié)果:(1)獲得了2株針對VP3蛋白的鼠單克隆抗體，mabVP3-1和mabVP3-2，都能很特異地與傳染性法氏囊病病毒VP3反應(yīng);(2)構(gòu)建了針對傳染性法氏囊病病毒VP3基因的RNA干擾慢病毒表達載體;(3)得到了穩(wěn)定干擾VP3基因的DF-1細胞系;(4)發(fā)現(xiàn)穩(wěn)定細胞系對病毒蛋白的表達以及病毒的復(fù)制有顯著的抑制作用。
　　結(jié)論:本研究獲得了2株針對VP3蛋白的特異性鼠單克隆抗體;首次采用慢病毒載體介導(dǎo)的RNA干擾技術(shù)建立