突變型白細(xì)胞介素-2的表達(dá)、純化及生物學(xué)活性測(cè)定.pdf

1、白細(xì)胞介素-2(IL-2)最初曾被稱為T細(xì)胞生長(zhǎng)因子，能促使各種造血細(xì)胞增殖和分化。臨床研究表明其關(guān)鍵作用可作為T淋巴細(xì)胞激活的增殖信號(hào)，因而將IL-2用于治療艾滋病?；谄淠艽碳ぞ哂屑?xì)胞毒的，抗腫瘤細(xì)胞的能力，IL-2還用于各種癌癥的治療。目前人IL-2已經(jīng)完全用基因工程的方法生產(chǎn)，而且基因工程IL-2與天然IL-2的功能和臨床效果基本一致。 目的：近年來，雖然基因工程產(chǎn)品IL-2應(yīng)用于肝炎及某些癌癥的治療已取得令人矚目的成果

2、，但大計(jì)量，長(zhǎng)時(shí)間用藥對(duì)病人存在一定的副作用，如發(fā)熱、寒戰(zhàn)、惡心、嘔吐、頭暈、乏力和毛細(xì)血管滲漏綜合癥等，所以，為了提高人重組白細(xì)胞介素-2的穩(wěn)定性和活性以及減少毒副作用，有必要定向改造rhIL-2的分子結(jié)構(gòu)，并在畢赤酵母中高效表達(dá)hIL-2cDNA，獲得hIL-2蛋白，擬對(duì)野生型hIL-2進(jìn)行結(jié)構(gòu)改造以獲得新的突變體，同時(shí)進(jìn)行活性測(cè)定，以便深入了解hIL-2的結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系。 方法：用PCR法從白細(xì)胞介素-2cDNA全序列中

3、擴(kuò)增成熟的肽基因片段，并利用定點(diǎn)突變技術(shù)將人重組白細(xì)胞介素-2第125位游離的半胱氨酸編碼序列突變?yōu)楸彼嵝蛄?；編碼18位亮氨酸的序列突變?yōu)榈鞍彼嵝蛄?；編碼19位亮氨酸的序列突變?yōu)榻z氨酸序列，經(jīng)限制酶片段分析與DNA序列分析證明后，獲得突變體MvhIL-2。IL-2基因片段與酵母中間載體pPIC9K融合后，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌TOP10F’，擴(kuò)增質(zhì)粒，獲得大量pPIC9K-MvhIL-2DNA后，再轉(zhuǎn)化畢赤酵母，并在搖瓶和發(fā)酵罐上對(duì)IL-2-

4、C125A/L18M/L19S進(jìn)行了表達(dá)。然后，利用離子交換層析的方法純化了MvhIL-2蛋白，利用IL-2依賴細(xì)胞株CTLL-2細(xì)胞對(duì)純化的突變蛋白(IL-2-C125A/L18M/L19S)和野生型IL-2(同樣方法獲得的)進(jìn)行測(cè)活。 結(jié)論：人IL-2cDNA可通過PCR技術(shù)進(jìn)行定點(diǎn)突變，所獲得的突變型MvhIL-2活性比天然型MvhIL-2高4-5倍。所以IL-2突變體(IL-2-C125A/L18M/L18S)較野生型的