甜瓜多聚半乳糖醛酸酶（PG）基因克隆及其反義序列植物表達載體構建.pdf

1、多數(shù)甜瓜(CucumismeloL.)果實的采后呼吸類型屬于躍變型，達到生理成熟的甜瓜果實采收后很快出現(xiàn)呼吸高峰，果肉迅速變軟，商品性和貯運性大大降低。據(jù)統(tǒng)計，新疆哈密瓜在銷售地的短期貯藏損耗達5﹪～15﹪，甘肅黃河蜜甜瓜運銷過程中的損耗率高達29.3﹪。實踐證明：選育出耐貯運品種能夠減少貯運過程中的損耗，是從根本上解決甜瓜貯運難題的有效途徑之一。 果實的成熟軟化與一定數(shù)量的果膠被降解有關，這主要是多聚半乳糖醛酸酶(Polyga

2、lacturonase，PG)作用的結果。大量研究證明，甜瓜果實成熟過程中，PG1的mRNA含量最為豐富，能夠降解果實細胞壁中的果膠質(zhì)。應用反義技術通過調(diào)控PG基因的表達進而延遲果實的成熟軟化在番茄上已取得成功，顯示出良好的商業(yè)化前景。在甜瓜上，Kristen等已成功克隆甜瓜PG1基因cDNA全序列，這為研究利用反義PG1基因技術調(diào)控甜瓜果實的成熟提供了可能。 本研究是甜瓜保鮮延熟分子育種研究項目中的一部分。項目的總體研究目標是

3、利用轉基因技術獲得貯運性狀優(yōu)異的甜瓜新品種。本研究的目標是運用基因克隆技術獲得甜瓜的PG1基因全序列，構建其反義序列植物表達載體，將該植物表達載體導入到模式植物煙草中，以檢驗構建的植物表達載體在植物中的正確表達，為甜瓜的遺傳轉化奠定基礎。 通過實驗研究獲得了如下結果：1.根據(jù)Kristen已發(fā)表的甜瓜PG1基因1182bp的cDNA全序列設計特異性引物，以從pCMPG/DH5a中提取的質(zhì)粒為模板進行PCR擴增，電泳檢測擴增產(chǎn)物并

4、回收目的片段后，將其與pGEM-TEasyVector連接。對經(jīng)藍白斑篩選得到的重組質(zhì)粒進行測序，序列分析結果表明與已知PG1基因核苷酸序列同源性高達99.33﹪。命名克隆載體為pGEM-PG。 2.用SacⅠ和XbaⅠ雙酶切pGEM-PG和pBI121兩種質(zhì)粒DNA，分別回收PG1基因片段和除去了gus基因的pBI121線狀載體，將pBI121線狀載體去磷酸化處理后與PG1基因反向連接，轉化大腸桿菌感受態(tài)細胞，獲得重組質(zhì)粒。對

5、重組質(zhì)粒經(jīng)PCR鑒定、SacⅠ和XbaⅠ雙酶切鑒定，均能獲得1.2kb的目的片段。用EcoRⅤ酶切重組質(zhì)粒，電泳圖譜出現(xiàn)1205bp的預期條帶，證明目的基因片段已反向插入。以上結果表明，成功構建植物表達載體pBI-aPG。 3.用限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ和HindⅢ雙酶切植物表達載體pBI-aPG，切下3'端加有CaMV35S啟動子和5'端加有NOS終止子的PG1反義基因單元35SP-aPG-NOST，隨后將其插入到pCAMBIA

6、2301質(zhì)粒載體上。對重組質(zhì)粒進行PCR鑒定，可以獲得約1200bp的電泳條帶，再進行EcoRⅠ和HindⅢ雙酶切，可切下約3.2kb的預期片段。同時，對挑取的質(zhì)粒進行XbaⅠ和SacⅠ雙酶切，也切下了預期大小為1.2kb的片段。由此可知，成功構建帶有gus報告基因的植物表達載體pCA-aPG。 4.采用直接轉化法分別將插入有反義PG1cDNA的植物表達載體pBI-aPG和pCA-aPG導入根癌農(nóng)桿菌菌株LBA4404中。通過抗