產(chǎn)聚半乳糖醛酸酶菌株的篩選、發(fā)酵條件及酶學(xué)性質(zhì)的研究.pdf

1、我國對聚半乳糖醛酸酶的研究、生產(chǎn)、應(yīng)用起步較晚,目前市售的聚半乳糖醛酸酶多以Aspergillus niger發(fā)酵生產(chǎn),酶制劑的產(chǎn)量和質(zhì)量均不能滿足食品工業(yè)的需求,且價格較貴。本實驗以腐爛水果、果園土壤、堆肥、生物肥料中分離出的120株菌株為出發(fā)菌株,經(jīng)過一系列的篩選、鑒定、誘變選育,得到1株高產(chǎn)聚半乳糖醛酸酶的Aspergillus terreus突變株,并對其做了發(fā)酵產(chǎn)酶條件和酶學(xué)性質(zhì)的研究。研究結(jié)果如下:
　　 采用染色透

2、明圈法初篩獲得20株水解透明圈直徑(Dp)與菌落直徑(Dc)比值較大的菌株。再通過液體發(fā)酵,測定粗酶液酶活力,復(fù)篩出5株編號為C1、C2、C3、G1、H4的高產(chǎn)聚半乳糖醛酸酶菌株,其酶活力分別達到17.89U/mL、17.68U/mL、18.37U/mL、14.04U/mL,13.56U/mL。最后經(jīng)過菌落形態(tài),顯微形態(tài)和生理生化特征的鑒定,結(jié)果為C1、C2、C3-土曲霉(Aspergillus terreus)；G1-互隔交鏈孢霉(A

3、lternaria alternate)；H4-黑曲霉(Aspergillus niger)。
　　 Aspergillus terreus C3分別經(jīng)紫外線(UV)、微波處理后,發(fā)現(xiàn)最佳照射時間分別為360s和50s,在此照射條件下,致死率分別達到86.89％和83.05％,正突變率為33.33％和20％。UV誘變篩選到突變菌株C3-A8,其酶活力提高了12.79％,且傳代穩(wěn)定性較好。微波誘變篩選到突變菌株C3-B5,其酶活力

4、提高了11.27％,但傳代穩(wěn)定性較差。突變株C3-A8和C3-B5分別以不同濃度的LiCl處理不同的時間后,發(fā)現(xiàn)5％LiCl處理5min為最佳條件,致死率分別為33.90％和32.14％,正突變率為8.33％和9.09％。UV-LiCl復(fù)合誘變篩選到突變菌株C3-A8-B6,其酶活力達到21U/mL,比原始菌株C3提高了14.32％,且傳代穩(wěn)定性較好。微波-LiCl復(fù)合誘變篩選到突變菌株C3-B5-D5,其酶活力為20.88U/mL,比

5、原始菌株C3提高了13.66％,但傳代穩(wěn)定性效果不理想。
　　 以篩選出的Aspergillus terreus突變株C3-A8-B6為研究菌株,通過單因素和正交實驗確定了最佳的培養(yǎng)基組分和發(fā)酵培養(yǎng)條件。已優(yōu)化的培養(yǎng)基組分為:豆餅粉5％,桔皮粉5％,NaNO20.6％,MgSO4·7H2O0.5mmoL/L,MnSO4·H2O0.75mmoL/L,K2HPO40.1％,CaCl20.75mmoL/L,BaCl21mmoL/L,F

6、eSO4·7H200.5mmoL/L。最適產(chǎn)酶的培養(yǎng)條件為:培養(yǎng)溫度30℃,初始pH5.0,裝液量為250mL三角瓶裝入45mL液體培養(yǎng)基,搖床轉(zhuǎn)速為190r/min,接種量為106個/mL孢子懸液7％(V/V),培養(yǎng)時間為4d。在此培養(yǎng)基和發(fā)酵條件下,菌株產(chǎn)酶活力可達44.642U/mL,較優(yōu)化前有明顯的提高。
　　 粗酶液經(jīng)過2次超濾濃縮,SephadexG-100凝膠柱層析,對該酶進行了分離純化,SDS-PAGE電泳檢驗了

7、其純度,且確定了該酶的分子量為39.87KDa。該酶的最適作用溫度為38℃,在38-53℃范圍內(nèi),酶活力穩(wěn)定,保溫1h后,酶活力均保留在90％以上。該酶的最適作用pH為5.0～6.0之間,在pH4.5～6.0之間,酶活力可保持90％以上。金屬離子Fe2+、Mg2+、Ca2+、Ba2+對酶活力有顯著的激活作用,Cu2+,Al3+對酶活力有較強的抑制作用。Na+、K+對酶活力的激活作用和Li+、Zn2+、Si2+對酶活力的抑制作用均不顯著。