三種雞球蟲的免疫蛋白組學(xué)研究及共同抗原的確定.pdf

1、雞球蟲病是養(yǎng)禽生產(chǎn)中一種分布廣泛、危害嚴重的原蟲病。目前為止雞球蟲病的防控主要以化學(xué)藥物為主。但隨著這些抗球蟲藥的普遍使用，新的問題不斷暴露出來，雞球蟲的耐藥性、抗球蟲藥的藥物殘留、動物源食品安全問題讓獸醫(yī)科技工作者陷入了更大的困擾。隨著科對球蟲免疫機理研究的不斷深入，研究人員將眼光放在了球蟲疫苗的研發(fā)上。本研究通過免疫蛋白質(zhì)組學(xué)的方法研究不同種雞球蟲的免疫原性抗原，旨在發(fā)現(xiàn)一批具有良好免疫原性的，3種球蟲之間的共同抗原，并對這些共同抗

2、原抵抗多種球蟲混合感染的效果進行評估，為臨床上雞球蟲的混合感染的預(yù)防提供參考。
　　1柔嫩艾美耳球蟲、堆型艾美耳球蟲和巨型艾美耳球蟲孢子化卵囊的免疫蛋白組學(xué)分析
　　采用免疫蛋白組學(xué)的方法，對E.tenella（柔嫩艾美耳球蟲）、E.acervulina(堆型艾美耳球蟲）和E.maxima（巨型艾美耳球蟲）三種雞球蟲的可溶性蛋白進行了免疫蛋白組學(xué)的分析。通過對3種球蟲孢子化卵囊蛋白的2-D電泳分析，分別檢測到626個E.ac

3、ervulina蛋白點，632個E.maxima蛋白點和629個E.tenella蛋白點。通過Western blot分析，E.tenella、E.acervulina和E.maxima分別有50個、64個和57個蛋白點能被雞球蟲抗血清識別。質(zhì)譜分析結(jié)果顯示112個蛋白點對應(yīng)了96種蛋白，其中烯醇化酶2，延長因子2，乳酸脫氫酶，3-磷酸甘油醛脫氫酶，14-3-3蛋白，微線蛋白2，遍在蛋白綴合酶結(jié)構(gòu)域等一些已知蛋白被檢索到。59個點檢索沒

4、有結(jié)果?；诿庖咴缘鞍椎牡脑诰€分析與序列比對，將核苷酸序列同源性在3個種之間在91％以上的抗原確定為共同抗原，最終我們得到延長因子2、遍在蛋白綴合酶結(jié)構(gòu)域、14-3-3蛋白、3-磷酸甘油醛脫氫酶四種共同抗原。
　　2兩種共同抗原基因克隆及真核表達質(zhì)粒的構(gòu)建
　　選取了ubiquitin-conjugating enzyme domain-containing protein,putative[Eimeriaacervuli

5、na]和14-3-3 protein，putative[Eimeria acervulina]兩個蛋白的基因?qū)ζ淇寺?。根?jù)它們的GenBank中收錄的核苷酸序列設(shè)計特異性引物。以堆型艾美耳球蟲的cDNA作為模板，對上述共同抗原基因進行PCR擴增，分別擴增出了444bp、837bp的片段，將擴增產(chǎn)物連接入pVAX1.0載體中，對陽性克隆進行雙酶切鑒定，并送至公司進行序列測定，并將測序的結(jié)果進行在線比對。結(jié)果顯示雙酶切鑒定切下了450、90

6、0bp左右的條帶，與預(yù)期目的條帶大小一致，序列測定結(jié)果顯示所得的核苷酸序列與GenBank中登陸的核苷酸序列(XM_013391686，XM_013394831)同源性為100％，表明已經(jīng)成功克隆出了共同抗原基因EaUCE和Ea14-3-3，并且成功構(gòu)建了真核表達質(zhì)粒pVAX-EaUCE和pVAX-Ea14-3-3。
　　3真核表達質(zhì)粒pVAX-EaUCE和pVAX-Ea14-3-3誘導(dǎo)T淋巴細胞亞類反應(yīng)和細胞因子變化
　　

7、用100μg真核表達質(zhì)粒pVAX-EaUCE和pVAX-Ea14-3-3經(jīng)腿部肌肉注射免疫14日齡雛雞，一周后加強免疫。首次免疫后7天和加強免疫后7天，分別分離雞脾臟淋巴細胞，用流式細胞術(shù)檢測CD4+/CD3+、CD8+/CD3+的比例。結(jié)果發(fā)現(xiàn)首免后第7天和2次免疫后7天，重組質(zhì)粒免疫組的的脾臟T淋巴細胞水平顯著高于PBS和pVAX1空質(zhì)粒對照組(P＜0.05)。結(jié)果表明，共同蛋白真核表達質(zhì)粒能夠有效地誘導(dǎo)雞T淋巴細胞反應(yīng)。用實時熒光

8、定量PCR方法，檢測脾臟中IFN-γ、IL-2、IL-4、TNFSF15、IL-17D和TGF-βmRNA水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，首免7天后和2次免疫第7天后，與PBS和空載體對照組相比，重組質(zhì)粒免疫組雞脾臟IFN-γ、IL-2、 TNFSF15、IL-17D和TGF-βmRNA水平顯著升高(P＜0.05)，表明共同抗原蛋白真核表達質(zhì)粒能夠有效地誘導(dǎo)雞體內(nèi)細胞因子分泌。
　　4真核表達質(zhì)粒pVAX-EaUCE和pVAX-Ea14-3-3誘

9、導(dǎo)的抗體反應(yīng)
　　使用2種構(gòu)建的pVAX-EaUCE和pVAX-Ea14-3-3真核表達質(zhì)粒免疫14日齡雛雞，對照組為PBS組和pVAX1空質(zhì)粒組。21日齡時，以同樣劑量進行二免。一周后心臟采血，分離血清。每隔一周心臟采血一次，持續(xù)6周。用堆型艾美耳球蟲孢子化卵囊可溶性蛋白作為包被抗原。通過間接ELISA方法檢測血清中IgG水平。結(jié)果表明，加強免疫后第一周到第六周，pVAX-EaUCE和pVAX-Ea14-3-3組抗體滴度顯著高于

10、PBS組和pVAX1空質(zhì)粒組。免疫組抗體滴度從第一周到第三周緩慢上升，并在第四周左右到達高峰，之后抗體滴度逐漸下降。而PBS組和pVAX1空質(zhì)粒組均未檢測到特異性抗體。試驗表明，構(gòu)建的真核表達質(zhì)粒pVAX-EaUCE和pVAX-Ea14-3-3均能誘導(dǎo)雞產(chǎn)生特異性抗體。
　　5真核表達質(zhì)粒pVAX-EaUCE和pVAX-Ea14-3-3的免疫保護性研究
　　將本試驗所構(gòu)建的pVAX-EaUCE和pVAX-Ea14-3-3分別

11、于14日齡雛雞腿部肌肉注射100μg真核表達質(zhì)粒pVAX-EaUCE和pVAX-Ea14-3-3，21日齡加強免疫。對照組注射PBS和pVAX1空質(zhì)粒。28日齡，除非免疫非攻蟲組外，其余分別經(jīng)口接種新鮮的E.tenella、E.acervulina、E.maxima和混合孢子化卵囊。6天后剖殺所有實驗雞，對增重、腸道內(nèi)容物卵囊數(shù)、腸道病變記分和抗球蟲指數(shù)(ACI)等指標進行統(tǒng)計。結(jié)果發(fā)現(xiàn)pVAX-Ea14-3-3免疫組，在感染E.ten

12、ella、E.acervulina、E.maxima和混合孢子化卵囊后，每組的ACI均大于160，說明真核表達質(zhì)粒pVAX-Ea14-3-3能夠?qū).tenella、E.acervulina、E.maxima和混合孢子化卵囊的感染起到良好的免疫保護效果;真核表達質(zhì)粒pVAX-EaUCE免疫組相比對照組，腸道病變值、卵囊數(shù)有所降低，雞的相對增重率比對照組要高，這說明我們構(gòu)建的真核表達質(zhì)粒pVAX-EaUCE和pVAX-Ea14-3-3不僅