大鼠肝移植慢性排斥反應(yīng)的蛋白組學(xué)研究.pdf

1、慢性排斥反應(yīng)(chronic rejection,CR)是影響移植病人遠(yuǎn)期生存的重要因素,且尚無早期臨床和病理診斷的方法。iTRAQ標(biāo)記的液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用(iTRAQ-LC-MS/MS)聯(lián)合生物信息分析軟件系統(tǒng)(Ingenuity Pathways Analysis,IPA)的使用,是尋找差異蛋白、篩選蛋白分子標(biāo)志物的理想工具。本研究在建立大鼠肝移植慢性排斥反應(yīng)模型基礎(chǔ)上,利用iTRAQ和IPA技術(shù)篩選肝移植慢性排斥反應(yīng)的差異蛋白,探討

2、慢性排斥反應(yīng)的可能發(fā)生機制以及診斷、治療的新靶點。
　　目的:
　　建立大鼠肝移植慢性排斥反應(yīng)模型,利用iTRAQ和IPA技術(shù)篩選相關(guān)差異蛋白,旨在探討慢性排斥反應(yīng)診斷、治療的新靶點和可能的發(fā)病機制。
　　方法:
　　1.優(yōu)化建立大鼠原位肝移植慢性排斥反應(yīng)模型:SD→Lewis大鼠肝移植分2種組合:A組CsA聯(lián)合氫化可的松干預(yù);B組CsA、氫化可的松及硫唑嘌呤三聯(lián)干預(yù)。每組合30例。分別于術(shù)后30、60、90和1

3、20d各隨機處死5只,觀察肝臟病理和外周血ALT和TBIL改變。各組除技術(shù)死亡的受鼠外,將余受鼠留做生存分析。
　　2.以SD-Lewis大鼠肝移植慢性排斥反應(yīng)模型為實驗組(n=20),SD-SD大鼠肝移植模型對照組:(n=20),術(shù)后120d實驗組和對照組各處死8只受體鼠,收集肝組織用于慢排反應(yīng)病理學(xué)觀察:將肝組織樣本進(jìn)行HE染色和特殊染色,光鏡下觀察移植肝匯管區(qū)炎癥、膽管炎癥損傷、阻塞性動脈病變以及肝組織纖維化。
　　3

4、.收集肝組織,利用iTRAQ標(biāo)記技術(shù)(同位素標(biāo)記相對和絕對定量技術(shù))的定量蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)和方法,通過對實驗組與對照組的蛋白表達(dá)量進(jìn)行比較,篩選出差異1.5倍以上(上調(diào)或下調(diào))的差異蛋白。
　　4.應(yīng)用生物信息學(xué)技術(shù)和軟件IPA分析所有蛋白的細(xì)胞定位、細(xì)胞功能以及參與的細(xì)胞信號通路,并根據(jù)此類信息分析篩選出初步的、有意義的特征差異蛋白。應(yīng)用IPA分析這些差異蛋白參與的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)和信號通路。
　　5.利用Real-timePCR、

5、WesternBlot及免疫組化方法驗證差異蛋白的表達(dá),進(jìn)一步篩選與肝移植慢性排斥反應(yīng)相關(guān)的生物標(biāo)志物。
　　結(jié)果:
　　1.肝移植各主要操作步驟時間:熱缺血時間<1min,供體手術(shù)20.0±1.5min,供肝修整3.5±1.5min,肝上下腔靜脈吻合8±1.5min,門靜脈重建2.5±1.0min,無肝期<15min,肝下下腔靜脈重建3±1.0min。A組(SD→Lewis,CsA1.0mg/kg/d+氫化可的松0.75m

6、g/kg/d)術(shù)后生存時間較B組(SD→Lewis,CsA1.0mg/kg/d+氫化可的松0.75mg/kg/d+Aza2mg/kg/d)明顯縮短。120d時,絕大多數(shù)A組受鼠出現(xiàn)典型慢性排斥反應(yīng)改變,肝臟縮小,質(zhì)硬,呈結(jié)節(jié)狀,病理染色表現(xiàn)為:肝小葉結(jié)構(gòu)不完整,肝組織顯著纖維化,纖維間隔形成;匯管區(qū)膽管破壞,膽管消失;動脈及其分支管壁炎癥性增厚,管腔縮小≥50％或完全閉塞;CRAI評分≥9分。A組慢排反應(yīng)較B組明顯。
　　2.應(yīng)用

7、iTRAQ聯(lián)合液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜(iTRAQ-LC-MS/MS)技術(shù),對慢排實驗組(SD-Lewis)和對照組(SD-SD)進(jìn)行定量比較蛋白質(zhì)組學(xué)研究,篩查與慢性排斥反應(yīng)相關(guān)的差異蛋白。質(zhì)譜鑒定總共得到24328條獨特肽段,對應(yīng)1056個非冗余蛋白質(zhì),設(shè)定差異1.5倍以上(上調(diào)或下調(diào))的蛋白認(rèn)為有意義,結(jié)果顯示有62個蛋白質(zhì)為肝移植術(shù)后慢性排斥反應(yīng)相關(guān)的差異蛋白質(zhì),其中32個蛋白表達(dá)上調(diào),30個蛋白表達(dá)下調(diào)。
　　3.經(jīng)IPA數(shù)據(jù)庫

8、(Ingenuity Knowledge Base,GenesOnly)的統(tǒng)計分析,共參與3個主要的通路網(wǎng)絡(luò)(參與網(wǎng)絡(luò)的蛋白超過15個)。其中脂質(zhì)代謝/分子轉(zhuǎn)運/小分子生物化學(xué)網(wǎng)絡(luò)中涉及蛋白23種,免疫系統(tǒng)疾病/皮膚疾病/結(jié)締組織疾病的功能網(wǎng)絡(luò)中涉及蛋白22種,而有15種蛋白則參與組成翻譯后蛋白修飾/蛋白質(zhì)折疊/遺傳疾病的功能網(wǎng)絡(luò)。另外Geneoncology功能分析顯示差異蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)涉及多條信號通路中的調(diào)控因子,包括:Meth

9、ioninesa lvagepathway、AMPK通路、mTOR通路以及GranzymeA途徑。
　　4.選取6種蛋白進(jìn)行Q-PCR及免疫組化驗證。與同品系對照組比較,Q-PCR結(jié)果顯示慢排組中Lcn2蛋白所對應(yīng)的基因表達(dá)上調(diào)(P<0.05),Krt19蛋白所對應(yīng)的基因表達(dá)下調(diào)(P<0.05)。免疫組化顯示慢排組織中Lcn2陽性表達(dá)率明顯高于對照組肝組織,兩組之間相比有差異(P<0.05)。慢排組織中Krt19明顯低表達(dá)(P<0

10、.05)。Lcn2和Krt19蛋白的表達(dá)情況與iTRAQ結(jié)果高度一致。
　　5.Westernblot檢測慢排反應(yīng)不同時間段(術(shù)后60d,90d,120d)Lcn2及Krt19蛋白的表達(dá)。Lcn2蛋白隨著慢性排斥反應(yīng)程度加重表達(dá)量增加,而Krt19蛋白隨著慢性排斥反應(yīng)程度加重表達(dá)量減少。
　　結(jié)論:
　　1.SD→Lewis(CsA1.0mg/kg/d+氫化可的松0.75mg/kg/d)組合的大鼠原位肝移植術(shù)后肝臟病理

11、改變、肝功能的變化及生存時間均符合臨床上肝移植術(shù)后慢性排斥反應(yīng)的特點,穩(wěn)定可靠,可重復(fù)性好,是研究肝移植慢性排斥反應(yīng)理想的動物模型。
　　2.iTRAQ-LC-MS/MS新技術(shù)具有易于操作、重復(fù)性好、快速、直觀、高通量觀察蛋白變化的特點,可應(yīng)用于尋找與慢性排斥反應(yīng)相關(guān)的差異蛋白,適于肝移植慢性排斥反應(yīng)的基礎(chǔ)研究。
　　3.IPA技術(shù)及GO分析可進(jìn)一步尋找與分析肝移植慢性排斥反應(yīng)相關(guān)的差異蛋白分子,并尋找其相互作用的網(wǎng)絡(luò)信號通