DEC1在原發(fā)性肝細(xì)胞性肝癌中的表達(dá)及其臨床意義.pdf

1、肝臟是人體最重要的器官之一，它對(duì)人類的生存是不可或缺的。肝臟在能量代謝、消化吸收、解毒、紅細(xì)胞的分解與清除、生化物質(zhì)比如血漿蛋白、激素等的合成和降解很多方面發(fā)揮著重要的作用。由于其在機(jī)體的不可替代的戰(zhàn)略性地位和它的多方面功能，肝臟與其他臟器相比也就更易于罹患多種疾病。其中包括病毒性肝炎，黃曲霉素B1中毒，酒精損傷，脂肪肝，肝硬化，腫瘤，藥物損害。其中原發(fā)性肝細(xì)胞性肝癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是由以上各

2、種慢性肝臟疾病所導(dǎo)致的的最嚴(yán)重的臨床轉(zhuǎn)歸。HCC直接威脅到人類健康和生命。
　　 原發(fā)性肝細(xì)胞性肝癌是最常見(jiàn)的原發(fā)惡性腫瘤之一，嚴(yán)重危害人類的身體健康。它惡性程度高，進(jìn)展快，預(yù)后差，侵襲性強(qiáng)。全球每年約有50至100萬(wàn)的新增病例，死亡患者接近六十萬(wàn)人。全世界肝癌發(fā)病率占腫瘤發(fā)病率的第五位，而病死率僅次于肺癌、胃癌，位居腫瘤相關(guān)死亡的第三位。其中約有80％的HCC患者發(fā)生于亞洲太平洋地區(qū)和南部非洲等地的發(fā)展中國(guó)家，這些地方同時(shí)又是

3、病毒性肝炎的高發(fā)區(qū)。近年來(lái)，由于丙型肝炎病毒(HCV)感染的增加，HCC在西方社會(huì)的發(fā)病率正在逐年上升。中國(guó)目前每年新發(fā)肝癌約三十六萬(wàn)例，死亡超過(guò)三十三萬(wàn)人，占我國(guó)癌癥發(fā)病率第三位和腫瘤相關(guān)死亡的第二位。HCC的發(fā)病是多因素、多步驟的復(fù)雜過(guò)程，受環(huán)境和遺傳雙重因素影響。流行病學(xué)及實(shí)驗(yàn)研究資料已表明乙型肝炎病毒(HBV)和HCV感染、黃曲霉毒素B1、酒精、肝硬化及性激素等與HCC發(fā)病相關(guān)。其中，HBV與HCV感染是最重要的因素，80％的H

4、CC與HBV或/和HCV的慢性感染有關(guān)。同時(shí)85％的HCC的患者合并肝硬化。這些不同背景的慢性肝臟疾病在疾病的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)歸也各有其特點(diǎn)。它們分別具有不同的遺傳、外在變化，包括不同的染色體異常、基因突變及不同的信號(hào)分子變化等。最近的研究發(fā)現(xiàn)，新陳代謝的失調(diào)，特別是脂代謝紊亂是慢性肝病導(dǎo)致HCC的主要誘因之一。
　　 bHLH(Basic helix-loop-helix)蛋白是一類具有堿性螺旋-環(huán)-螺旋(bHLH)結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)錄因

5、子，該家族成員可通過(guò)HLH結(jié)構(gòu)域相互作用形成同源或異源二聚體，并由HLH結(jié)構(gòu)區(qū)的氨基端的堿性區(qū)識(shí)別并結(jié)合細(xì)胞類型特異性基因啟動(dòng)子或增強(qiáng)子中的E-box位點(diǎn)，從而調(diào)節(jié)這些基因的轉(zhuǎn)錄。由此bHLH蛋白在細(xì)胞分化、發(fā)育、增殖及腫瘤發(fā)生過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。DEC1(Differentiatedembryo-chondrocyte expressed gene1)蛋白具有bHLH結(jié)構(gòu)域，屬于bHLH類轉(zhuǎn)錄因子家族成員。它在機(jī)體各種生理功能中發(fā)揮重

6、要的作用，比如細(xì)胞分化、增殖、凋亡、缺氧反應(yīng)、免疫耐受和腫瘤形成。作為主要的時(shí)鐘調(diào)節(jié)分子，DEC1與DEC2一起組成第五個(gè)時(shí)鐘基因家族。它們與CLOCK、BMAL1、PER和CRY一起參與調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)水平的生物周期節(jié)律。近年來(lái)DEC1在物質(zhì)能量代謝和維持機(jī)體穩(wěn)態(tài)方面的作用正在逐步被我們所認(rèn)識(shí)。DEC1在機(jī)體多層面、多角度、多階段的不同作用預(yù)示著它可能位于機(jī)體調(diào)節(jié)的焦點(diǎn)位置；聯(lián)系各種功能、整合多種變化從而保持機(jī)體的穩(wěn)態(tài)。在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過(guò)

7、程中，DEC1的作用有組織細(xì)胞類別的特異性，在組織類型不同，起源不同的腫瘤中和腫瘤發(fā)展的不同階段，DEC1具有不同的表達(dá)模式，可能扮演者不同的角色：在乳腺癌中，高表達(dá)的DEC1與腫瘤的高侵襲性相關(guān)；在胃癌中，DEC1在分化差，惡性程度高的患者中表達(dá)增加；與癌旁組織相比較，結(jié)腸癌組織中高表達(dá)DEC1；DEC1參與介導(dǎo)由UVB導(dǎo)致皮膚癌的信號(hào)傳導(dǎo)過(guò)程；而在肺癌中，DEC1的表達(dá)的報(bào)道存在相反的兩種結(jié)論。DEC1與腫瘤發(fā)生發(fā)展關(guān)系的研究尚處于

8、起步階段，具體作用機(jī)制尚不明確。DEC1作為癌基因或是抑癌基因，在不同來(lái)源的腫瘤及腫瘤發(fā)展的不同階段所起的作用還需要進(jìn)一步的研究和歸納。在肝臟中，已有研究發(fā)現(xiàn)，DEC1參與肝細(xì)胞的生物周期節(jié)律調(diào)節(jié)、新陳代謝的維護(hù)和再生性控制等各方面的調(diào)控。但是DEC1在肝臟疾病，特別是HCC形成中的作用還不清楚。到目前為止，還未見(jiàn)到原發(fā)性肝癌與DEC1關(guān)系的系統(tǒng)研究報(bào)道。為了探討DEC1在原發(fā)性肝細(xì)胞性肝癌發(fā)生、發(fā)展中所起的作用。我們對(duì)DEC1在肝癌細(xì)

9、胞、組織中的表達(dá)及其與原發(fā)性肝癌發(fā)生發(fā)展的關(guān)系進(jìn)行了研究。
　　 目的：研究DEC1與原發(fā)性肝癌發(fā)生發(fā)展的關(guān)系，探討其在原發(fā)性肝癌發(fā)病機(jī)制中的作用和意義。
　　 方法和步驟：
　　 研究對(duì)象：組織標(biāo)本取自山東大學(xué)附屬千佛山醫(yī)院和濟(jì)南市中心醫(yī)院病理科，于2006年1月至2009年5月期間手術(shù)切除并經(jīng)病理證實(shí)。176例肝組織標(biāo)本包括126例來(lái)自于63例肝癌患者的癌組織及與其相對(duì)應(yīng)的癌旁組織，50例正常肝組織標(biāo)本來(lái)自于

10、肝血管瘤患者的手術(shù)切除組織。所有的患者手術(shù)前均未接受過(guò)放射性治療或化療等抗腫瘤治療。血管瘤患者根據(jù)病毒學(xué)指標(biāo)檢查均無(wú)病毒感染。63例肝細(xì)胞性肝癌患者中男52例，女11例。年齡35-77歲，中位數(shù)年齡56歲。50例血管瘤患者中男17例，女33例。標(biāo)本的選取是隨機(jī)的，并經(jīng)過(guò)了當(dāng)?shù)貍惱砦瘑T會(huì)的批準(zhǔn)。63例肝癌患者的病理分級(jí)包括：高分化18例，中、低分化45例。收集患者的性別、年齡、腫瘤大小、HBV感染情況、是否伴隨肝硬化和AFP水平等臨床相關(guān)

11、參數(shù)進(jìn)行分析。
　　 隨機(jī)選取12例乳腺癌標(biāo)本和5例肺癌標(biāo)本作為對(duì)照。12例乳腺癌根據(jù)組織學(xué)分級(jí)包括：Ⅰ級(jí)3例，Ⅱ級(jí)7例，Ⅲ級(jí)2例。5例肺癌包括2例腺癌和3例鱗癌。
　　 人肝癌細(xì)胞株：SMMC-7721，HepG-2，Bel-7402，Hep-3B細(xì)胞由本室傳代培養(yǎng)保存；人正常肝上皮細(xì)胞株HL-7702由山東大學(xué)醫(yī)學(xué)院免疫教研室饋贈(zèng)。
　　 RT-PCR法檢測(cè)肝癌細(xì)胞中DEC1mRNA的表達(dá)：利用TRizol法

12、分別提取細(xì)胞總RNA，采用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)檢測(cè)DEC1mRNA在肝癌細(xì)胞和正常肝上皮細(xì)胞的表達(dá)情況。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)按照既定的反應(yīng)體系進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。反應(yīng)條件：50℃30min，99℃5min，5℃5min。PCR反應(yīng)在PCR儀中擴(kuò)增，DEC1基因的PCR引物序列：上游：5’-gtaccctgcccacatgtacc-3’下游：5’-gcttggccagatactgaagc-3’擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為395bp，反應(yīng)條件為：94℃20

13、sec，56℃20sec，72℃20sec共35個(gè)循環(huán)。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.5％瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。
　　 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)肝癌細(xì)胞DEC1的表達(dá)：應(yīng)用流式的方法初步檢測(cè)肝癌細(xì)胞株Bel-7402中DEC1蛋白的表達(dá)情況。Bel-7402細(xì)胞中加入抗DEC1多克隆抗體，37℃搖床上孵育90分鐘。PBS緩沖液清洗后，加入FITC標(biāo)記的二抗，室溫孵育25分鐘。1％多聚甲醛固定后，上機(jī)(FACSCalibur flow cytometr

14、y)檢測(cè)。熒光標(biāo)記物測(cè)定時(shí)，同時(shí)設(shè)立陰性對(duì)照管。
　　 細(xì)胞免疫化學(xué)方法檢測(cè)DEC1蛋白在肝癌細(xì)胞的表達(dá)及亞細(xì)胞定位：人正常肝上皮細(xì)胞株HL-7702，肝癌細(xì)胞株HepG-2、Bel-7402分別傳代后培養(yǎng)24小時(shí)，檢測(cè)DEC1的表達(dá)和亞細(xì)胞定位。為避免肝細(xì)胞中內(nèi)源性生物素的干擾，采用非生物素標(biāo)記的免疫組化試劑盒(KIT-5010，Max Vision，Maixin.Bio，China)。棕色顆粒沉著代表DEC1蛋白表達(dá)陽(yáng)性。<

15、br>　　 肝組織中內(nèi)源性生物素對(duì)免疫組織化學(xué)結(jié)果的干擾現(xiàn)象：在檢測(cè)肝癌組織中STAT5a的表達(dá)時(shí)，分別以生物素標(biāo)記和非生物素標(biāo)記的二抗對(duì)同一來(lái)源的肝組織切片進(jìn)行免疫組化測(cè)定。檢測(cè)肝組織細(xì)胞中內(nèi)源性生物素在肝組織免疫組化中的的干擾作用。評(píng)價(jià)肝組織細(xì)胞中內(nèi)源性生物素對(duì)肝組織免疫組化的干擾狀況，從而選擇特異性強(qiáng)的免疫組化方法和試劑。
　　 免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)肝組織中DEC1的表達(dá)：免疫組化方法檢測(cè)DEC1蛋白在肝癌組織及其癌旁組

16、織的表達(dá)情況，分析DEC1的表達(dá)與肝癌分化程度的相關(guān)性，及與肝癌臨床病理參數(shù)間的關(guān)系。將甲醛固定、石蠟包埋的標(biāo)本于切片機(jī)上切取4μm厚的組織切片，放入60℃電熱恒溫培養(yǎng)箱中60 min。依次進(jìn)行脫蠟、水化處理。將切片放入盛有0.01M枸櫞酸緩沖液(PH6.8)的耐熱容器中，放入高壓鍋內(nèi)煮沸3分鐘進(jìn)行抗原修復(fù)。3％過(guò)氧化氫溶液室溫下孵育10 min滅活內(nèi)源性過(guò)氧化氫酶。加入抗DEC1多克隆抗體，4℃濕盒過(guò)夜。二抗為非生物素標(biāo)記(KIT-5

17、010，Max Vision，Maixin.Bio，China)。DAB顯色5分鐘，蘇木素復(fù)染，透明、封片。乳腺癌組織切片作為陽(yáng)性對(duì)照，以PBS液代替一抗作為陰性對(duì)照。結(jié)果通過(guò)雙盲法由兩位有經(jīng)驗(yàn)的病理專家獨(dú)立評(píng)估。取結(jié)果一致的標(biāo)本進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。
　　 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：
　　 采用SPSS11.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。分類變量用卡方檢驗(yàn)和Fisher校正檢驗(yàn)分析。DEC1表達(dá)量與肝癌分化程度之間的相關(guān)性則采用Spearma

18、n相關(guān)性分析，p<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)果：
　　 1.DEC1mRNA在人正常肝上皮細(xì)胞株HL-7702中和人肝癌細(xì)胞株：SMMC-7721，HepG-2，Bel-7402和Hep-3B細(xì)胞中均有表達(dá)。結(jié)果通過(guò)分析軟件對(duì)條帶灰度進(jìn)行半定量分析，以內(nèi)參基因(β-actin)調(diào)整mRNA量的差異。結(jié)果顯示正常人肝上皮細(xì)胞中DEC1的表達(dá)量高于人肝癌細(xì)胞株，但差別沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。提示DEC1在轉(zhuǎn)錄水平的差異并

19、不明顯。
　　 2.流式細(xì)胞檢測(cè)結(jié)果顯示DEC1在肝癌細(xì)胞株Bel-7402中的標(biāo)記率為56％，提示DEC1蛋白在肝癌細(xì)胞株Bel-7402中有高表達(dá)。
　　 3.免疫細(xì)胞化學(xué)染色結(jié)果可以對(duì)DEC1蛋白表達(dá)進(jìn)行亞細(xì)胞定位，在人正常肝上皮細(xì)胞株HL-7702，肝癌細(xì)胞株HepG-2、Bel-7402中，DEC1蛋白在細(xì)胞核及細(xì)胞漿中表達(dá)陽(yáng)性，但以HL-7702細(xì)胞核DEC1蛋白表達(dá)較強(qiáng)。
　　 4.生物素標(biāo)記和非生

20、物素標(biāo)記抗體在肝組織免疫組化中的應(yīng)用差別：對(duì)同一來(lái)源的肝組織標(biāo)本，應(yīng)用生物素標(biāo)記的二抗檢測(cè)肝組織細(xì)胞中的目的抗原時(shí)，胞漿內(nèi)有彌散分布的棕黃色顆粒；而應(yīng)用非生物素標(biāo)記的二抗，胞漿的顯色則為陰性。
　　 5.正常肝組織標(biāo)本中DEC1的表達(dá)特點(diǎn)：在正常肝組織中，DEC1的表達(dá)模式為：彌散性的肝細(xì)胞胞漿陽(yáng)性表達(dá)，伴隨著不同程度的胞核陽(yáng)性表達(dá)。中央靜脈周圍的肝細(xì)胞胞漿中可見(jiàn)DEC1蛋白的顆粒性表達(dá)，而在匯管區(qū)周圍的肝細(xì)胞胞漿中沒(méi)有這種表達(dá)

21、方式。DEC1蛋白不同的肝細(xì)胞胞漿表達(dá)模式可能與肝小葉特殊的解剖結(jié)構(gòu)及獨(dú)特的血液供應(yīng)模式有關(guān)。中央靜脈周圍通常低氧、低養(yǎng)分、并具有較高的酸度，這些特點(diǎn)可能導(dǎo)致了肝細(xì)胞的顆粒型表達(dá)模式；DEC1蛋白的彌散型表達(dá)模式可能是非缺氧依賴性的。血管內(nèi)皮細(xì)胞和膽管上皮細(xì)胞呈現(xiàn)不同程度的DEC1表達(dá)陽(yáng)性。
　　 6.肝癌及癌旁組織中DEC1的表達(dá)特點(diǎn)：在幾乎所有肝組織標(biāo)本中的肝細(xì)胞中，DEC1在細(xì)胞漿中均有彌散性表達(dá)。肝癌組織中DEC1核表達(dá)

22、的陽(yáng)性率為57.1％(36/63)；而在相對(duì)應(yīng)的癌旁組織中DEC1核表達(dá)的陽(yáng)性率為27.0％(17/63)。與肝癌組織相比，癌旁組織中DEC1的核表達(dá)降低(P=0.001)。正常對(duì)照中的DEC1的核表達(dá)率略高于肝癌組織，差別沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.650)。與正常對(duì)照肝組織中的DEC1核表達(dá)率相比，癌旁表達(dá)低(P=0.002)，這可能與腫瘤的機(jī)械性擠壓和肝細(xì)胞對(duì)于肝癌細(xì)胞的反應(yīng)性有關(guān)。
　　 7.DEC1的核表達(dá)與臨床參數(shù)之間的

23、關(guān)系：肝癌組織中有36例標(biāo)本DEC1核表達(dá)陽(yáng)性，其中占高分化、中分化和低分化肝癌的百分比分別為：94.4％(17/18)，42.4％(14/33)和41.7％(5/12)。DEC1的核表達(dá)率與肝癌組織分化程度有關(guān)。在高分化肝癌中DEC1的核表達(dá)率高于中、低分化的肝癌，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。DEC1的核表達(dá)與性別、年齡、腫瘤大小、乙型肝炎病毒感染和肝硬化等臨床參數(shù)無(wú)關(guān)。具體數(shù)據(jù)可能與樣本量偏小有關(guān)，尚需大樣本資料證實(shí)。

24、>　　 8.DEC1核表達(dá)與肝癌分化程度的關(guān)系：作為轉(zhuǎn)錄因子，DEC1通常在細(xì)胞核內(nèi)發(fā)揮作用。我們發(fā)現(xiàn)，在分化程度好的肝細(xì)胞性肝癌中，DEC1的核陽(yáng)性表達(dá)率及核陽(yáng)性表達(dá)強(qiáng)度均較高。在分化較差的肝細(xì)胞性肝癌中，DEC1的核表達(dá)較弱，甚至不表達(dá)DEC1蛋白。我們比較了DEC1的核免疫反應(yīng)性與肝細(xì)胞性肝癌分化狀態(tài)的關(guān)系。在高分化、中度分化和低分化肝癌中，DEC1核高表達(dá)的比率分別為83.3％，27.3％和16.7％.DEC1蛋白的核表達(dá)強(qiáng)度

25、與肝細(xì)胞性肝癌的組織分化程度呈正相關(guān)(r=0.376，P=0.024)。
　　 結(jié)論：
　　 1.人肝組織標(biāo)本肝細(xì)胞胞漿的內(nèi)源性生物素影響著免疫組化結(jié)果的判斷，因此對(duì)于此類標(biāo)本，應(yīng)首先選擇非生物素標(biāo)記的二抗。
　　 2.在肝癌細(xì)胞株中和正常肝上皮細(xì)胞株中，DEC1mRNA均有表達(dá)，DEC1蛋白在胞漿和胞核中均有表達(dá)。DEC1在肝臟的諸多日常功能中可能發(fā)揮重要作用。免疫組織化學(xué)方法證實(shí)DEC1在肝細(xì)胞內(nèi)有兩種表達(dá)模

26、式，彌散型和顆粒型。彌散型的表達(dá)模式可能是非缺氧依賴型的。顆粒型的表達(dá)模式與中央靜脈周圍的特殊環(huán)境因素有關(guān)。
　　 3.證實(shí)在肝細(xì)胞性肝癌組織中，DEC1的核表達(dá)與肝癌的分化程度相關(guān)，DEC1的表達(dá)量與分化程度成正比。DEC1可以作為肝細(xì)胞性肝癌分化程度的標(biāo)志物之一。為進(jìn)一步探索DEC1基因功能及其在肝臟腫瘤中的生物學(xué)作用奠定了基礎(chǔ)。DEC1的表達(dá)、調(diào)節(jié)和作用有組織特異性。在肝臟中，DEC1參與調(diào)節(jié)物質(zhì)、能量代謝和時(shí)鐘控制等多種

27、生理功能，并且與腫瘤的生成有關(guān)，因此DEC1可能位于這個(gè)復(fù)雜轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)的中心位置。機(jī)體組織、細(xì)胞中DEC1表達(dá)的紊亂打破了整體的穩(wěn)態(tài)，從而導(dǎo)致細(xì)胞不正常的增殖、分化和死亡和癌癥的發(fā)生。
　　 4.DEC1參與正常肝細(xì)胞的生物周期節(jié)律調(diào)節(jié)、新陳代謝的維護(hù)和再生性控制等各方面的調(diào)控。在正常肝細(xì)胞中發(fā)揮重要的穩(wěn)態(tài)作用，其中主要是通過(guò)核內(nèi)表達(dá)的DEC1蛋白發(fā)揮轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用。而在肝癌組織中隨分化程度由高到低，DEC1核表達(dá)逐漸降低，其作