RNA干擾抑制人肺癌細(xì)胞HMGB1基因表達(dá)的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、背景和目的: 肺癌是嚴(yán)重威脅人類健康和生命的惡性腫瘤，其發(fā)病率將在相當(dāng)長時(shí)期內(nèi)呈現(xiàn)顯著上升趨勢，已成為引起世界上癌癥死亡率最主要原因。高遷移率族蛋白B1（high mobility group box B1，HMGB1），是一種存在于真核生物細(xì)胞內(nèi)的非組蛋白染色體結(jié)合蛋白，參與多種生物學(xué)過程包括諸如基因轉(zhuǎn)錄、DNA修復(fù)等功能。HMGB1過表達(dá)有抑制細(xì)胞凋亡，誘導(dǎo)細(xì)胞分化、細(xì)胞遷移、細(xì)胞增殖等作用2。最近研究表明它不但是一種轉(zhuǎn)錄因

2、子和促生長因子，而且是一種重要的炎性細(xì)胞因子，并與腫瘤的發(fā)生、浸潤、轉(zhuǎn)移等生物學(xué)行為關(guān)系密切，有很大的臨床價(jià)值。HMGB1在肺癌中的研究處于起步和探索階段。國內(nèi)外并無其他關(guān)于HMGB1在肺癌中全方位系統(tǒng)性研究的文獻(xiàn)報(bào)道。本研究在人肺鱗癌細(xì)胞株YTMLC-9、人肺腺癌細(xì)胞株A549、人大細(xì)胞肺癌細(xì)胞株L9981及人小細(xì)胞癌細(xì)胞株NCI-H446中篩選高表達(dá)HMGB1的細(xì)胞株，作為人肺癌細(xì)胞HMGB1基因研究的理想材料，為下一步進(jìn)行的RNA

3、i實(shí)驗(yàn)研究的細(xì)胞模型的選擇奠定了基礎(chǔ)；設(shè)計(jì)針對HMGB1為靶點(diǎn)的siRNA，觀察通過RNA干擾抑制HMGB1基因表達(dá)后，高表達(dá)HMGB1的人肺癌細(xì)胞株L9981增殖和侵襲能力的改變，體外驗(yàn)證HMGB1基因做為治療靶點(diǎn)的可行性；為臨床開發(fā)應(yīng)用和探索腫瘤治療的新途徑提供實(shí)驗(yàn)和理論基礎(chǔ)；應(yīng)用RNA干擾聯(lián)合基因芯片技術(shù)檢測HMGB1表達(dá)下調(diào)后肺癌細(xì)胞基因表達(dá)譜的差異情況，篩選與HMGB1相互作用的基因及可能的信號通路，探討HMGB1基因在肺癌中

4、的作用機(jī)制。 方法: 1、常規(guī)培養(yǎng)人肺鱗癌細(xì)胞株YTMLC-9、人肺腺癌細(xì)胞株A549、人大細(xì)胞肺癌細(xì)胞株L9981及人小細(xì)胞癌細(xì)胞株NCI-H446，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR和Western blot方法對人肺癌細(xì)胞HMGB1基因在4株細(xì)胞中的mRNA和蛋白水平的表達(dá)進(jìn)行檢測，篩選出高表達(dá)HMGB1基因的人肺癌細(xì)胞株。 2、根據(jù)siRNA設(shè)計(jì)原則，設(shè)計(jì)合成靶向HMGB1基因的siRNA，采用陽離子脂質(zhì)體試劑瞬時(shí)轉(zhuǎn)

5、染已經(jīng)篩選出的高表達(dá)HMGB1的人大細(xì)胞肺癌細(xì)胞株L9981，利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR和Western blot檢測RNA干擾后HMGB1基因的沉默效果，評價(jià)siRNA設(shè)計(jì)的合理性及RNA干擾抑制HMGB1表達(dá)的有效性；確定RNA干擾抑制HMGB1表達(dá)確實(shí)有效后，培養(yǎng)人大細(xì)胞肺癌細(xì)胞株L9981，分為3組進(jìn)行RNA干擾研究，分別為轉(zhuǎn)染靶向HMGB1基因的siRNA組，轉(zhuǎn)染無關(guān)序列組和空白對照組，于RNA干擾后48小時(shí)，用細(xì)胞活力計(jì)數(shù)儀測定

6、3組細(xì)胞活力；分別在RNA干擾后24、48、72和96小時(shí)應(yīng)用MTT實(shí)驗(yàn)檢測3組細(xì)胞生存狀態(tài)，計(jì)算生長抑制率并繪制生長曲線；應(yīng)用boyden chamber法檢測3組侵襲能力的差異。 3、采用陽離子脂質(zhì)體試劑向人肺癌細(xì)胞L9981轉(zhuǎn)染靶向HMGB1基因的siRNA，下調(diào)HMGB1的表達(dá)。應(yīng)用Affymetrix HU133 plus2基因芯片檢測人肺癌細(xì)胞L9981 HMGB1基因表達(dá)下調(diào)后，全基因表達(dá)譜的變化，并應(yīng)用GCOS（

7、Gene-Chip Operation Software）軟件分析篩查數(shù)據(jù)，對相關(guān)基因和信號通路進(jìn)行綜合分析。 結(jié)果： 1、人肺鱗癌細(xì)胞株YTMLC-9、人肺腺癌細(xì)胞株A549、人大細(xì)胞肺癌細(xì)胞株L9981及人小細(xì)胞癌細(xì)胞株NCI-H446中均有HMGB1基因表達(dá)，其中人大細(xì)胞肺癌細(xì)胞株L9981表達(dá)水平最高，mRNA是表達(dá)量最低的人肺腺癌細(xì)胞株A549mRNA表達(dá)量的10．3倍，人大細(xì)胞肺癌細(xì)胞株L9981與其它3種人

8、肺癌細(xì)胞株比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0．01）。 2、靶向HMGB1的siRNA成功抑制人大細(xì)胞肺癌細(xì)胞株L9981中HMGB1基因及蛋白表達(dá)（P=0．000），細(xì)胞活力檢測儀測定RNA干擾48小時(shí)后，空白對照組和陰性對照組細(xì)胞活力顯著大于siRNA轉(zhuǎn)染組；MTT測定siRNA轉(zhuǎn)染組細(xì)胞生長抑制率顯著大于空白對照組和陰性對照組；boyden chamber小室細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果siRNA轉(zhuǎn)染組穿膜細(xì)胞數(shù)明顯減少，與空白對照組和陰性

9、對照組比較，差異有顯著性（P<0．05）。 3、RNA干擾抑制人大細(xì)胞肺癌細(xì)胞株L9981HMGB1基因表達(dá)后，GCOS軟件分析基因芯片分析其表達(dá)譜的變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)1433個(gè)探針表達(dá)明顯改變，對應(yīng)有明確名稱的基因?yàn)?79個(gè)，其中上調(diào)的基因有295個(gè)，下調(diào)的有584個(gè)；EST序列216個(gè)，其中上調(diào)96個(gè)，下調(diào)120個(gè)。差異基因共涉及131個(gè)信號通路，主要為肺癌、鈣信號通路、細(xì)胞通訊、細(xì)胞因子受體相互作用、ErbB信號通路、細(xì)胞基質(zhì)

10、黏附、細(xì)胞遷移、細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、Jak-STAT信號通路、MAPK信號通路、p53信號通路、細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡以及Wnt信號通路等相關(guān)通路。經(jīng)過Milano網(wǎng)站分析，其中678個(gè)基因有報(bào)道。在這678個(gè)基因中，與肺癌（檢索詞lung cancer）有相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道的有209個(gè)，與癌癥（檢索詞cancer）有相關(guān)報(bào)道的有526個(gè)，與侵襲（檢索詞invasion）有相關(guān)報(bào)道的有170個(gè)，或轉(zhuǎn)移（檢索詞metastasis）有相關(guān)報(bào)道的有194個(gè)

11、。 結(jié)論： 1、本研究在國內(nèi)外首次報(bào)道HMGB1在人肺鱗癌細(xì)胞株、腺癌細(xì)胞株、大細(xì)胞癌細(xì)胞株及小細(xì)胞癌細(xì)胞株等4株肺癌細(xì)胞中的表達(dá)水平，篩選出HMGB1高表達(dá)的人肺癌細(xì)胞株L9981，HMGB1低表達(dá)的人肺癌細(xì)胞株A549，人大細(xì)胞肺癌L9981細(xì)胞株為HMGB1高表達(dá)細(xì)胞株，可作為進(jìn)行肺癌細(xì)胞中研究HMGB1的實(shí)驗(yàn)材料。 2、成功設(shè)計(jì)了靶向HMGB1的siRNA，應(yīng)用RNA干擾技術(shù)在國內(nèi)外首次將靶向HMGB1的

12、siRNA轉(zhuǎn)染至篩選出的高表達(dá)HMGB1的肺癌細(xì)胞株中，并成功的高效地下調(diào)人肺癌細(xì)胞L9981HMGB1基因的表達(dá)，成功構(gòu)建了轉(zhuǎn)染HMGB1的siRNA的肺癌細(xì)胞株和轉(zhuǎn)染無關(guān)序列的肺癌細(xì)胞株。人肺癌細(xì)胞L9981HMGB1基因下調(diào)后，細(xì)胞增值和侵襲能力顯著被抑制，表明HMGB1可作為人肺癌基因治療潛在的靶點(diǎn)。 3、本研究在國內(nèi)外首先應(yīng)用表達(dá)譜芯片研究人肺癌細(xì)胞L9981HMGB1基因下調(diào)后，其細(xì)胞基因表達(dá)譜變化情況，確定表達(dá)差異

13、基因879個(gè)，主要涉及肺癌、鈣信號通路、細(xì)胞通訊、細(xì)胞因子受體相互作用、ErbB信號通路、細(xì)胞基質(zhì)黏附、細(xì)胞遷移、細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、Jak-STAT信號通路、MAPK信號通路、p53信號通路、細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡以及Wnt信號通路等方面。經(jīng)過Milano網(wǎng)站分析，其中678個(gè)基因有報(bào)道。在這678個(gè)基因中，與肺癌（檢索詞lung cancer）、侵襲和轉(zhuǎn)移（檢索詞metastasis）報(bào)道較多的基因中。篩選出與肺癌、侵襲和轉(zhuǎn)移相關(guān)報(bào)道較多的基