靶向Survivin基因RNA干擾抑制人腺樣囊性癌細(xì)胞生長的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的： 涎腺腺樣囊性癌(salivaryadenoidcysticcarcinoma,SACC)，是一種涎腺惡性腫瘤。其特點(diǎn)是惡性程度高，侵襲性強(qiáng)，易復(fù)發(fā)、易早期轉(zhuǎn)移，且對(duì)放療、化療不敏感，手術(shù)治療難以根除。因此，尋求有效的輔助性治療手段非常必要。腫瘤基因治療已成為最引人矚目的研究領(lǐng)域，是繼手術(shù)、放療、化療之后的又一種治療模式。本研究采用RNA干擾技術(shù)阻斷凋亡抑制因子Survivin在腺樣囊性癌細(xì)胞中的表達(dá)，觀察其對(duì)于ACC細(xì)胞

2、生物學(xué)行為的影響，并對(duì)其作用機(jī)制作初步探討。 方法： 本實(shí)驗(yàn)針對(duì)SurvivinmRNA設(shè)計(jì)和構(gòu)建特異性的siRNA重組干擾質(zhì)粒；采用脂質(zhì)體介導(dǎo)法轉(zhuǎn)染人腺樣囊性癌細(xì)胞株ACC-2，以WesternBlot和RT-PCR法檢測SurvivinsiRNA對(duì)ACC-2細(xì)胞Survivin和Caspase-3表達(dá)的變化；并應(yīng)用MTT法檢測穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的ACC-2細(xì)胞株增殖的變化；采用透射電鏡技術(shù)、TUNEL，法和流式細(xì)胞技術(shù)檢測細(xì)胞

3、凋亡，觀察細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)改變以及細(xì)胞周期的變化。 結(jié)果： 1、經(jīng)上海生工生物工程技術(shù)有限公司測序，成功獲得重組克隆測序結(jié)果，結(jié)果表明，成功構(gòu)建靶點(diǎn)特異性的SurvivinsiRNA重組質(zhì)粒。 2、以DOTAP脂質(zhì)體介導(dǎo)法將SurvivinsiRNA轉(zhuǎn)染人腺樣囊性癌細(xì)胞株ACC-2。在熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞，成功轉(zhuǎn)染的細(xì)胞通常因?yàn)楣餐磉_(dá)的綠色熒光蛋白從而發(fā)綠色熒光。經(jīng)過G418的篩選后，獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)染siSurvivi

4、n質(zhì)粒的ACC-2細(xì)胞克隆。 3、細(xì)胞內(nèi)Survivin蛋白及mRNA表達(dá)相對(duì)水平是非處理組的35％和27％；Survivin表達(dá)顯著降低。 4、細(xì)胞內(nèi)Caspase-3蛋白及mRNA表達(dá)相對(duì)水平是非處理組的189％和134％，Caspase-3表達(dá)明顯增多。 5、MTT實(shí)驗(yàn)提示：隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長，Survivin基因沉默組的OD值較對(duì)照組明顯降低，細(xì)胞增殖明顯受抑制。 6、透射電鏡觀察可見Surviv

5、in基因沉默組ACC細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)呈凋亡樣改變，出現(xiàn)線粒體腫脹及細(xì)胞漿濃縮特征性表現(xiàn)。 7、TUNEL檢測發(fā)現(xiàn)Survivin基因沉默組呈棕黃色染色的凋亡細(xì)胞較對(duì)照組有明顯增多。 8、流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期，細(xì)胞在G1期比例明顯增多，而在G2/M期有所減少。 結(jié)論： 1、siRNA重組干擾質(zhì)粒轉(zhuǎn)染能夠高效地抑制ACC-2細(xì)胞株SurvivinmRNA和蛋白的表達(dá)，并成功篩選出最有效沉默Survivin表達(dá)的