GPC3過(guò)表達(dá)對(duì)肝癌Huh-7細(xì)胞生物學(xué)功能影響的研究.pdf

1、[目的]
　　 GPC3是一種膜性硫酸乙酰肝素多糖蛋白，在肝癌組織中有特異性的高表達(dá)。目前大多數(shù)學(xué)者主要通過(guò)抑制GPC3在肝癌細(xì)胞中的表達(dá)，檢測(cè)肝細(xì)胞癌的生物學(xué)行為改變明顯受到抑制，從而認(rèn)為GPC3是作為一種促癌基因?qū)Ω伟┘?xì)胞起作用。但是在間皮瘤、卵巢癌細(xì)胞系、乳腺癌和肺癌中發(fā)現(xiàn)GPC3是由于其啟動(dòng)子的過(guò)甲基化而造成蛋白表達(dá)缺失，提示GPC3可能發(fā)揮抑癌基因作用，而且在肝癌的研究中也發(fā)現(xiàn)類似現(xiàn)象。本課題選擇高表達(dá)GPC3基因的h

2、uh-7細(xì)胞，通過(guò)上調(diào)GPC3的表達(dá)后檢測(cè)huh-7細(xì)胞的生物學(xué)功能的變化，旨在進(jìn)一步研究GPC3在肝癌中發(fā)揮抑癌基因的作用。
　　 [方法]
　　 1、通過(guò)脂質(zhì)體法將GPC3基因過(guò)表達(dá)真核表達(dá)質(zhì)粒瞬間轉(zhuǎn)染至Huh-7細(xì)胞。
　　 2、應(yīng)用熒光定量PCR和Western Blot檢測(cè)GPC3mRNA和蛋白的表達(dá)，驗(yàn)證GPC3基因過(guò)表達(dá)。
　　 3、采用Annexin V-FITC/PI雙染經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測(cè)

3、細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡。
　　 4、利用EDU檢測(cè)細(xì)胞增殖。
　　 5、運(yùn)用Transwell法檢測(cè)細(xì)胞遷移和侵襲能力。
　　 [結(jié)果]
　　 1、構(gòu)建基因GPC3 CDS克隆入真核表達(dá)載體pcDNA3.1+中的GPC3測(cè)序F為5'GATTCAGCCTTGGACATCAATG3'，與原始序列完全一致，表明已成功構(gòu)建GPC3真核表達(dá)載體pcDNA3.1+，可以用于后續(xù)過(guò)表達(dá)實(shí)驗(yàn)。
　　 2、GPC3真核

4、表達(dá)載體pcDNA3.1+瞬時(shí)轉(zhuǎn)染Huh-7細(xì)胞72h后熒光定量PCR和Western Blot檢測(cè)顯示GPC3mRNA和蛋白表達(dá)都明顯高于對(duì)照組，表明成功上調(diào)Huh-7細(xì)胞的GPC3表達(dá)水平，可進(jìn)行后續(xù)的細(xì)胞生物學(xué)行為研究實(shí)驗(yàn)。
　　 3、在過(guò)表達(dá)Huh-7細(xì)胞組、Huh-7細(xì)胞組和NC組中，在G1期的細(xì)胞數(shù)分別為(49.77±2.08)％、（49.28±1.0）％和（50.29±1.52）％(P＞0.05);在G2期的細(xì)胞數(shù)

5、分別為（7.92±1.0）％、(11.89±2.0)％和(12.49±0.58)％(P＜0.05);S期所占的細(xì)胞數(shù)分別為(42.31±3.06)％、(38.83±1.73)％和（37.22±2.0）％(P＜0.05);表明過(guò)表達(dá)GPC3將Huh-7細(xì)胞分裂周期阻滯在S期。
　　 4、在過(guò)表達(dá)Huh-7細(xì)胞組、Huh-7細(xì)胞組和NC組中，細(xì)胞凋亡率分別為（23.71±0.01）％、（9.4±0.02）％和（9.19±0.01）％

6、(P＜0.01);表明過(guò)表達(dá)GPC3后能夠明顯誘導(dǎo)Huh-7細(xì)胞的凋亡。
　　 5、在過(guò)表達(dá)Huh-7細(xì)胞組、Huh-7細(xì)胞組和NC組中，瞬時(shí)轉(zhuǎn)染GPC3過(guò)表達(dá)質(zhì)粒48小時(shí)后，細(xì)胞增值率分別為（87.06±1.58）％、（90.12±1.93）％和（91.02±0.35）％（P＜0.05），提示GPC3過(guò)表達(dá)后可使Huh-7細(xì)胞的增殖降低。
　　 6、在過(guò)表達(dá)Huh-7細(xì)胞組、Huh-7細(xì)胞組和NC組中，細(xì)胞遷移率分別為

7、(14.03±0.92)％、（54.60±1.01）％和（32.87±0.29）％（P＜0.01），這說(shuō)明過(guò)表達(dá)GPC3能夠抑制Huh-7細(xì)胞的遷移。
　　 7、在過(guò)表達(dá)Huh-7細(xì)胞組、Huh-7細(xì)胞組和NC組中，細(xì)胞侵襲分別為（4.93±0.38）％、（7.13±0.83）％和(10.53±0.06％)(P＜0.05)，表明過(guò)表達(dá)GPC3后Huh-7細(xì)胞的侵襲能力明顯受到抑制。
　　 [結(jié)論]
　　 將過(guò)表達(dá)