沉默Gpc3基因?qū)Ω伟┘?xì)胞生物學(xué)行為的影響.pdf

1、前言:
　　肝細(xì)胞肝癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是最常見(jiàn)的消化道惡性腫瘤之一，位居全球癌癥相關(guān)性死因的第三位，特別是在發(fā)展中國(guó)家。HCC的發(fā)生是多基因多步驟的過(guò)程，涉及許多增殖、凋亡相關(guān)基因的改變。HCC與潛在的血管侵襲、轉(zhuǎn)移相關(guān)，多數(shù)HCC患者診斷時(shí)已處于晚期失去了手術(shù)的機(jī)會(huì)，導(dǎo)致HCC的五年生存率較低、預(yù)后較差。因此，對(duì)肝細(xì)胞肝癌的早期診斷及治療提出了迫切的要求。
　　磷脂酰肌醇蛋白聚糖

2、-3（Glypican-3，GPC3）是一種新的肝細(xì)胞肝癌腫瘤標(biāo)志物，對(duì)肝癌的診斷及治療具有重要意義，是硫酸乙酰肝素蛋白聚糖家族的一員，由胎兒肝臟產(chǎn)生，在胚胎發(fā)育期調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖及存活。GPC3基因在HCC發(fā)生過(guò)程中可能通過(guò)參與不同的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路而調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖、凋亡、侵襲粘附及分化能力。GPC3基因在HCC中特異性高表達(dá)而在正常組織及癌旁組織中幾乎不表達(dá)或低表達(dá)的特性使其成為HCC新的腫瘤標(biāo)志物及潛在基因治療靶點(diǎn)。
　　慢病毒載

3、體介導(dǎo)的RNA干擾(RNA interference，RNAi)就是將慢病毒載體高效感染和整合的特性與RNA干擾特異性抑制同源基因表達(dá)的作用相結(jié)合。慢病毒載體解決了RNAi容易被降解，性質(zhì)不穩(wěn)定，細(xì)胞攝取率不高及在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的安全性等問(wèn)題。
　　本研究擬通過(guò)應(yīng)用慢病毒載體介導(dǎo)的RNA干擾技術(shù)，使肝癌細(xì)胞中GPC3基因的表達(dá)下調(diào)，觀察沉默GPC3基因?qū)Ω伟┘?xì)胞增殖、凋亡、侵襲、遷移能力的影響，進(jìn)而探索GPC3基因在肝癌的發(fā)生發(fā)展中所

4、起的作用。
　　材料與方法:
　　一、實(shí)驗(yàn)材料
　　細(xì)胞株:肝癌HepG2細(xì)胞株購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞庫(kù)。293T細(xì)胞株由本室保存。
　　二、研究方法
　　1、構(gòu)建沉默GPC3基因的慢病毒載體，并穩(wěn)定轉(zhuǎn)染肝癌HepG2細(xì)胞。
　　2、應(yīng)用RT-PCR，Western blot分別從mRNA和蛋白水平檢測(cè)轉(zhuǎn)染前后GPC3基因在肝癌細(xì)胞中表達(dá)情況的變化。
　　3、細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)檢測(cè)轉(zhuǎn)染后

5、肝癌細(xì)胞的增殖能力的變化。
　　4、流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)轉(zhuǎn)染后肝癌細(xì)胞凋亡能力的變化。
　　5、Transwell侵襲小室、細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)轉(zhuǎn)染后肝癌細(xì)胞的侵襲遷移能力的變化。
　　6、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理:實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)3次，采用SPSS17.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)據(jù)結(jié)果以(x)±s表示，以P＜0.05為判斷差異顯著性標(biāo)準(zhǔn)。
　　結(jié)果:
　　1、經(jīng)酶切鑒定，測(cè)序結(jié)果表明GPC3-shRNA慢病毒載體構(gòu)建正確，并測(cè)定滴

6、度為1×108TU/ml。最適感染復(fù)數(shù)(MOI)為10，最佳感染時(shí)間為72h。
　　2、轉(zhuǎn)染后，轉(zhuǎn)染組GPC3基因的mRNA及蛋白表達(dá)較陰性對(duì)照組及空白對(duì)照組下調(diào)。
　　3、沉默GPC3基因的轉(zhuǎn)染組較陰性對(duì)照組及空白對(duì)照組相比，增殖能力下降。
　　4、轉(zhuǎn)染后，肝癌細(xì)胞的凋亡細(xì)胞數(shù)較陰性對(duì)照組及空白對(duì)照組增加。
　　5、轉(zhuǎn)染后經(jīng)過(guò)48h的培養(yǎng)，肝癌細(xì)胞穿過(guò)matrigel膠的細(xì)胞數(shù)較陰性對(duì)照組及空白對(duì)照組相比減少，

7、遷移的速度較陰性對(duì)照組及空白對(duì)照組減慢。
　　結(jié)論:
　　1、成功構(gòu)建了GPC3-shRNA慢病毒載體。
　　2、慢病毒載體介導(dǎo)的RNA干擾，能穩(wěn)定的轉(zhuǎn)染肝癌細(xì)胞，并在mRNA及蛋白水平下調(diào)肝癌細(xì)胞中GPC3基因的表達(dá)。
　　3、沉默肝癌細(xì)胞中的GPC3基因的表達(dá)，可抑制肝癌細(xì)胞的增殖，誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞的凋亡，降低肝癌細(xì)胞對(duì)matrigel膠的粘附能力，降低其侵襲遷移能力。
　　4、GPC3基因在肝細(xì)胞肝癌中起