小檗堿抑制植物根生長的機理研究.pdf

1、小檗堿（Berberine）是一種常見的異喹啉生物堿，廣泛應用于醫(yī)藥和農(nóng)業(yè)領域。本文以三葉鬼針草（Bidens pilosa L.）、擬南芥（Arabidopsis thaliana L.）和煙草BY-2懸浮細胞（Nicotiana tabacum Brightyellow-2）為材料，研究了小檗堿的生物活性、吸收傳導和作用機理，為小檗堿作為一種新的植物源除草劑的應用提供理論基礎和科學根據(jù)。
　　小檗堿、草甘膦（Glyphosat

2、e）、二甲戊靈（Pendimethalin）和2,4-D處理三葉鬼針草7 d后，對三葉鬼針草根長的IC50值分別是3.27、3.45、6.97和0.23 mg·L-1，對三葉鬼針草鮮重的IC50值分別是6.11、7.72、15.21和0.92 mg·L-1；小檗堿、草甘膦、二甲戊靈和2,4-D處理擬南芥7 d后，對擬南芥根長的IC50值分別是0.25、0.52、3.51和0.0024 mg·L-1，對擬南芥鮮重的IC50值分別是6.00

3、、5.25、13.74和1.21 mg·L-1，可以看出，小檗堿對三葉鬼針草和擬南芥的室內(nèi)除草活性與草甘膦和二甲戊靈相當。
　　以0、5、10、20、40和80 mg·L-1的小檗堿處理煙草細胞1 d后，細胞死亡率分別為7.45％、9.90%、14.29%、30.99%、53.08%和63.76%；處理2 d后，細胞死亡率分別為8.52%、11.97%、19.69%、35.91%、60.36%和78.47%。對照藥劑草甘膦在5、1

4、0、20、40和80 mg·L-1的濃度下處理煙草細胞1 d后，細胞死亡率分別為9.40%、20.03%、31.23%、43.18%和55.75%；處理2 d后，細胞死亡率分別為11.21%、26.08%、39.11%、48.03%和61.65%?？梢钥闯?，小檗堿對煙草細胞的活性與草甘膦相當。
　　由于小檗堿具有和常用商品化除草劑草甘膦和二甲戊靈相當?shù)氖覂?nèi)生物活性，因此，研究小檗堿的吸收傳導相關特性，對小檗堿的田間應用具有重要的指

5、導意義。以32 mg·L-1的小檗堿通過水培、涂莖和涂葉等不同施藥方式處理4~6葉期的三葉鬼針草幼苗，結果發(fā)現(xiàn)水培的植株被顯著抑制，1、2、3、5和7 d，隨著時間的增加，根長、株高、根鮮重和整株鮮重的抑制率持續(xù)上升，但涂莖和涂葉兩種方法并沒有造成明顯抑制。采用水培法和葉片涂藥法研究小檗堿在三葉鬼針草植株內(nèi)的傳導，通過HPLC分析，32 mg·L-1的小檗堿水培三葉鬼針草幼苗0.5、1、2、3、5和7 d后，根中小檗堿濃度分別為51.6

6、9、63.59、76.74、50.45、38.33和27.38μg·g-1，莖中小檗堿濃度分別為6.41、8.05、12.33、19.23、14.58和9.09μg·g-1，葉中小檗堿濃度分別為0、0、2.76、3.17、3.14和2.63μg·g-1，隨著時間的延長，在根、莖、葉中均能檢測到小檗堿；而采用葉片涂藥法處理，經(jīng)過0.5、1、2、3、5和7 d后，只在三葉鬼針草的葉部檢測到小檗堿。由此可看出，小檗堿主要通過植物的根部吸收并進

7、行傳導，在三葉鬼針草植株內(nèi)有自下而上的傳導性，而沒有自上而下的傳導性。進一步用32 mg·L-1的小檗堿通過水培法處理4葉期的三葉鬼針草0.5、1、2、3和5 d后，切片后，采用熒光顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，小檗堿主要通過植物維管束從根向莖葉進行傳導，結果表明小檗堿是通過質外體系傳導。
　　以模式植物擬南芥為實驗材料進行作用機理初步研究表明，小檗堿能顯著抑制擬南芥主根的生長，使擬南芥根尖分生區(qū)皮層的細胞數(shù)量顯著減少。由于生長素在根形態(tài)建成中

8、具有重要意義，所以我們推測小檗堿可能對根部細胞分裂素和生長素運輸系統(tǒng)產(chǎn)生了影響。以野生型擬南芥及其生長素響應元件轉基因系（DR5:GUS）和細胞周期蛋白轉基因系（CYCB1:GUS）為實驗材料研究發(fā)現(xiàn)，小檗堿影響了生長素在擬南芥根尖部位的分布和含量，影響了CYCB1在擬南芥根部的表達，且研究結果還提示小檗堿除草可能與對照藥劑草甘膦和二甲戊靈，存在截然不同的作用機制，值得深入研究。
　　以擬南芥PIN1:GFP和PIN2:GFP標記

9、系為實驗材料研究發(fā)現(xiàn)，10 mg·L-1小檗堿影響了PIN1和PIN2在根尖的表達量，并使PIN1喪失在細胞膜上的極性定位功能。進一步的RT-PCR研究發(fā)現(xiàn)，小檗堿對 PIN1、IAA14、AIR1、AUX1、PIN3和 PIN7基因的轉錄表達能夠產(chǎn)生一定的影響。同時研究發(fā)現(xiàn)2 mg·L-1的小檗堿可使擬南芥根尖分生區(qū)內(nèi)皮層的細胞數(shù)量顯著減少，但在此濃度下，對生長素在根尖的分布和含量的影響并不十分明顯，所以我們推測，植物最初響應小檗堿的

10、靶標可能并不在生長素信號轉導系統(tǒng)。由于小檗堿導致 PIN1喪失在細胞膜上的定位功能，由此推測，其作用位點可能位于細胞膜系統(tǒng)。
　　因此，以煙草細胞為實驗材料進一步研究了小檗堿對細胞膜的影響。以0、5、10、20、40和80 mg·L-1小檗堿處理煙草細胞8 h后，以流式細胞儀測定了煙草細胞線粒體膜電位的變化，細胞平均熒光強度值分別為92.80、89.31、89.87、87.79、76.64和72.34，隨著濃度的升高，處理組熒光強

11、度峰均有所下降，其中40和80 mg·L-1處理的與對照差異顯著，小檗堿對煙草細胞線粒體膜電位影響顯著，但并不能誘導煙草細胞凋亡，可以看出，小檗堿對細胞膜系統(tǒng)產(chǎn)生了影響。在此基礎上，進一步研究了小檗堿對細胞膜組成成分的影響。采用12.5~200 mg·L-1的小檗堿水培處理8葉期的三葉鬼針草植株后，收集根部樣品，用GC-MS測量樣品中脂肪酸的含量，在三葉鬼針草根中，脂肪酸組分最多的是棕櫚酸（C16）和硬脂酸（C18），約占總脂肪酸的55

12、％，小檗堿能顯著的影響根中脂肪酸的含量；經(jīng)12.5~50 mg·L-1的小檗堿處理后，IUFA百分比逐漸增大，但濃度從50~200 mg·L-1逐漸升高時IUFA百分比逐漸減少，結果表明，一定濃度的小檗堿會造成三葉鬼針草不可逆變化，IUFA百分比持續(xù)下降，從而影響細胞膜的流動性，造成質膜過氧化。
　　進一步研究小檗堿對細胞形態(tài)和超微結構影響結果表明，煙草細胞經(jīng)小檗堿處理后采用DAPI染色研究發(fā)現(xiàn)，高濃度的小檗堿（40和80 mg·

13、L-1）嚴重影響了煙草細胞細胞核的形態(tài)，細胞核出現(xiàn)不規(guī)則形狀、顆粒化等。通過SEM（掃描電鏡）和TEM（透射電鏡）分析三葉鬼針草和擬南芥的根尖表面及分生區(qū)細胞，發(fā)現(xiàn)0.5 mg·L-1的小檗堿可使擬南芥分生區(qū)細胞中的線粒體數(shù)量明顯減少，隨著小檗堿濃度的增加，可以使根尖表面出現(xiàn)明顯的凹陷和分生區(qū)細胞壞死等。TEM分析小檗堿對煙草細胞影響的結果表明，隨著小檗堿濃度的增加及處理時間的延長，煙草細胞變形和質壁分離現(xiàn)象越來越明顯，線粒體和細胞壁等

14、的降解也越明顯。
　　綜上所述，植物源除草化合物小檗堿具有與草甘膦和二甲戊靈相當?shù)氖覂?nèi)除草活性。其主要作用位點在植物根部，由根吸收后自下而上傳導，先引起根部的生長受到抑制，隨后可引起整株的生長受到抑制。小檗堿能顯著影響植物細胞分裂，影響生長素輸出載體蛋白 PIN1在細胞膜上的極性定位功能，引起線粒體膜電位的變化，破壞根部IUFA的平衡，引起細胞膜質過氧化。小檗堿雖然不能引起植物細胞凋亡，但可引起植物細胞直接壞死。植物響應小檗堿的最