Botryosphaeria dothidea突變體庫的構(gòu)建和突變體篩選及T-DNA插入位點側(cè)翼序列分析.pdf

1、Botryosphaeria dothidea是重要的林果潰瘍病害病原，分布廣，危害重，寄主多樣。該病菌引起的病害在20多個國家均有報道，在我國引起的危害亦為嚴重。因此，明確病菌的致病機制對于有效防控林果潰瘍病具有重要意義。目前對于B.dothidea研究主要集中在形態(tài)分類、系統(tǒng)發(fā)育、遺傳多樣性以及防治方法等方面，但對其致病的分子機制缺乏系統(tǒng)研究。突變體庫的建立和致病相關(guān)基因的分離和功能鑒定是深入解析病菌致病分子機理基礎(chǔ)，可為病害防控提

2、供理論依據(jù)。
　　本研究在已建立的農(nóng)桿菌介導(dǎo)（Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation，ATMT）的遺傳轉(zhuǎn)化體系基礎(chǔ)上構(gòu)建了B.dothidea突變體庫，得到1053個轉(zhuǎn)化子，通過繼代培養(yǎng)和PCR檢測證明T-DNA插入到B.dothidea基因組中。對突變體庫進行了系統(tǒng)的分析，篩選獲得了一些與該病菌生長發(fā)育及致病性相關(guān)的突變體，并進一步對部分突變菌株的T-DNA插入位點的右

3、翼序列進行了擴增和分析，研究結(jié)果如下：
　?。?）以野生型菌株B.dothidea SDAU11-126為對照，對526個轉(zhuǎn)化子的菌落形態(tài)、生長特性及致病性測定，篩選到8株突變體菌株：
　　①菌株LW-27在PDA上氣生菌絲致密但不茂盛，菌落淡黃色，其生長速率和致病性均最小，生長速率和致病性與野生型都有顯著差異且分別降低了28.64％和54.90%；
　?、诰闘W-22在PDA上氣生菌絲致密也不茂盛，菌落淡黃色，其生

4、長速率和致病性均不存在顯著差異；
　?、劬闘W-7在PDA上氣生菌絲疏松旺盛，菌落初為白色，后為灰褐色，生長速率和致病性與野生型均存在顯著差異且分別增長了27.60%和13.76%；
　?、芫闘W-31在PDA上氣生菌絲疏松茂盛，菌落乳白色，其生長速率和致病性與野生型均增強且存在顯著差異，分別提高了29.35%和15.65%；
　?、菥闘W-26在PDA上氣生菌絲致密但不茂盛，菌落乳白色，其生長速率較野生型存在顯

5、著差異且降低了24.43%，但其致病性與野生型不存在顯著差異；
　　⑥菌株LW-64在PDA上氣生菌絲疏松不茂盛，菌落邊緣有水溶現(xiàn)象，菌落紅褐色，生長速率和致病性與野生型不存在顯著差異；
　?、呔闘W-100在PDA上氣生菌絲疏松不旺盛，菌落呈輪紋狀，紅褐色，生長速率和致病性與野生型不存在顯著差異；
　?、郘W-111在PDA上氣生菌絲疏松且茂盛，菌落呈同心輪紋狀、乳白色，生長速率與野生型存在顯著差異且增長了27.8

6、3%，但其致病性與野生型不存在顯著差異。
　?。?）通過hiTAIL-PCR技術(shù)對篩選得到的4個突變體菌株進行右側(cè)翼序列擴增，其突變體LW-27的右側(cè)翼序列大小為994bp，經(jīng)序列比對為甘油激酶（Glycerol kinase） 基因；LW-64的右側(cè)翼序列大小為1105bp，經(jīng)序列比對為GDP-甘露糖焦磷酸化酶（GDP-mannose pyrophosphorylase）基因；LW-100的側(cè)翼序列大小為1097bp，