淡紫擬青霉T-DNA插入突變體庫構(gòu)建與分析.pdf

1、植物寄生線蟲是植物侵染性病害的重要病原物之一，分布廣泛，其寄主范圍廣，危害嚴(yán)重，而且受害植物更易受真菌和細(xì)菌侵染，成為誘發(fā)植物其他病害的重要原因之一.對于植物線蟲的防治，歷來以化學(xué)藥劑為主，而且仍是目前防治中的一個重要措施，在防治有害生物和保障農(nóng)業(yè)增產(chǎn)方面起了積極作用。但是化學(xué)藥劑的長期大量使用產(chǎn)生“3R”等諸多問題，其應(yīng)用日益受到限制。生物防治的研究為植物線蟲的防治提供了一條安全、可靠的途徑。其中，淡紫擬青霉[Paecilomyces

2、lilacinus(Thom)Samson]對線蟲寄生率高，寄主范圍廣，防治效果顯著，被認(rèn)為是最具前途的防治有害線蟲的生防真菌之一。 淡紫擬青霉既是經(jīng)濟(jì)重要的病原真菌，也是研究微生物與植物寄生線蟲相互作用的重要生物，從全基因組水平分析研究該菌關(guān)鍵基因的功能，可以加速對淡紫擬青霉生物學(xué)及其致病分子機(jī)制的認(rèn)識，為培育持久抗病品種和制定植物寄生線蟲持續(xù)管理的策略提供理論依據(jù)。為此，本研究利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化T-DNA插入技術(shù)，構(gòu)建淡紫擬

3、青霉T-DNA插入突變體庫，并對部分突變體進(jìn)行了分析，具體研究如下： 首先構(gòu)建了含抗除草劑基因(bar)和綠色熒光蛋白GFP的淡紫擬青霉遺傳轉(zhuǎn)化表達(dá)載體。構(gòu)建的方法為：在表達(dá)載體pCAMBIA1302的基礎(chǔ)上構(gòu)建適合于擬青霉遺傳轉(zhuǎn)化的表達(dá)載體，對pCAMBIA1302的選擇標(biāo)記基因及其啟動子進(jìn)行了改造，構(gòu)建了兩個載體pTBAR和pGBAR。構(gòu)建的結(jié)果如下：通過PCR方法從pC30RG載體中擴(kuò)增得到Trpc啟動子，從pGAPZα-

4、A載體中擴(kuò)增得到Gap啟動子，將適用于真菌表達(dá)的啟動子Trpc、Gap分別替換pCAMBIA1302中靠近左邊界位于選擇標(biāo)記潮霉素基因上游的Camv35S啟動子；再根據(jù)設(shè)計的保守引物通過PCR方法從pBHt2載體中擴(kuò)增獲得bar基因替換選擇標(biāo)記潮霉素基因，構(gòu)成載體pTBAR和pGBAR。 通過電擊轉(zhuǎn)化將兩個表達(dá)載體分別導(dǎo)入根癌農(nóng)桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)GV3103中，成功轉(zhuǎn)化了淡紫擬青霉，并對轉(zhuǎn)化

5、效率進(jìn)行了優(yōu)化，包括選擇轉(zhuǎn)化子的除草劑草甘膦銨鹽原藥(Glyphosateammonium)敏感性測定，抑制根癌農(nóng)桿菌的抗生素頭孢霉素(Cef)的劑量，誘導(dǎo)劑乙酰丁香酮(AS)及共培養(yǎng)時間和受體菌淡紫擬青霉?jié)舛鹊鹊挠绊憽６啻无D(zhuǎn)化結(jié)果表明：在AS加入量為.200μg/mL，P.LicinusE7孢子濃度為106個/mL的轉(zhuǎn)化條件下，在根癌農(nóng)桿菌生長濃度OD600為0.3-0.4左右，共培養(yǎng)時間為14小時時，在抗性篩選培養(yǎng)基上所出現(xiàn)的抗性轉(zhuǎn)

6、化子個數(shù)最多，每轉(zhuǎn)化106個P.LicinusE7分生孢子可以得到約250個插入轉(zhuǎn)化子。且轉(zhuǎn)化子繼代6代后，轉(zhuǎn)化子仍保持穩(wěn)定的抗性。從中隨機(jī)選取抗性轉(zhuǎn)化子30個進(jìn)行bar基因的PCR檢測，其中有11個擴(kuò)增得到目的片段。通過熒光顯微鏡檢測，陽性轉(zhuǎn)化子可發(fā)出綠色熒光，證明含bar基因的T-DNA已插入淡紫擬青霉基因組中。 本實(shí)驗(yàn)共獲得含bar基因的抗性轉(zhuǎn)化子1453個，與出發(fā)菌株P(guān).LE7對比轉(zhuǎn)化子中絕大部分菌落型態(tài)與原始菌相似，只

7、有少數(shù)轉(zhuǎn)化子在菌落顏色、形態(tài)、生長速度等方面有不同程度差異：如菌落顏色明顯加深且有輪狀紋的T101.；白色突變體T629。而轉(zhuǎn)化子的菌絲、分生孢子的形態(tài)及大小均沒有發(fā)現(xiàn)明顯的變化。隨機(jī)抽取60株轉(zhuǎn)化子進(jìn)行毒力測定分析，研究發(fā)現(xiàn)3個疑似致病性減弱突變體，12個致病性增強(qiáng)突變體，其中有4株具有高毒性明顯高于P.LilaciusE7，對線蟲的校正致死率都超過60％，室內(nèi)盆栽試驗(yàn)和小區(qū)試驗(yàn)都表現(xiàn)良好的生防效果。 農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化淡紫擬青霉