內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激與膿毒癥脾淋巴細(xì)胞異常凋亡.pdf

1、目的：采用盲腸結(jié)扎穿孔的方法復(fù)制小鼠膿毒癥動(dòng)物模型，觀察膿毒癥時(shí)小鼠脾臟淋巴細(xì)胞凋亡的情況，檢測(cè)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)伴侶蛋白GRP78、CHOP基因mRNA及蛋白表達(dá)的變化，分析上述變化在脾淋巴細(xì)胞凋亡中的意義，以探討內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激與膿毒癥脾淋巴細(xì)胞異常凋亡之間的關(guān)系。 方法：選擇體重為18-25g、雄性、C57BL/6小鼠60只，隨機(jī)分為假手術(shù)組(sham)30只，模型組(CLP)30只。術(shù)前12小時(shí)禁食，采用乙醚全麻。Sham組麻醉后開(kāi)腹翻動(dòng)

2、腸管尋找盲腸，但不做結(jié)扎和穿孔；CLP組開(kāi)腹后找到盲腸，1號(hào)線行末端盲腸結(jié)扎，保留回盲瓣結(jié)構(gòu)和血運(yùn)，18號(hào)針于結(jié)扎盲腸上穿孔1個(gè)，擠出少量糞便均勻分布于結(jié)扎盲腸表面，結(jié)扎盲腸還納腹腔后關(guān)腹，制成膿毒癥的動(dòng)物模型。所有動(dòng)物術(shù)后即刻用0.5ml生理鹽水皮下注射，進(jìn)行液體復(fù)蘇。每組動(dòng)物隨機(jī)等分，一半用于術(shù)后一般情況及生存率觀察，繪制生存率曲線；另一半術(shù)后存活時(shí)間大于24小時(shí)者，于術(shù)后24小時(shí)麻醉活殺，剖腹觀察腹腔情況后留取脾臟即刻液氮凍存和4

3、％多聚甲醛固定，分別用于組織勻漿的制備和病理組織學(xué)檢查。留取肝臟、肺、腸組織用于病理組織學(xué)檢查。采用終末脫氧核糖核酸轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的原位缺口末端標(biāo)記術(shù)(TUNEL)檢測(cè)脾淋巴細(xì)胞凋亡情況。采用RT-PCR、免疫組化、WesternBlot檢測(cè)脾臟GRP78、CHOP基因mRNA及蛋白表達(dá)變化情況。SPSS11.5統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)士標(biāo)準(zhǔn)差表示，以P<0.05或P<0.01作為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 結(jié)果：1)膿毒癥

4、動(dòng)物模型的確認(rèn)施行CLP手術(shù)后的小鼠出現(xiàn)精神萎靡、嗜睡、反應(yīng)遲鈍、活動(dòng)差、怕冷、聚居、豎毛、厭食、眼角分泌物增多等表現(xiàn)，24小時(shí)存活率達(dá)到93％左右，72h自然死亡率為33％。而Sham組術(shù)后表現(xiàn)與術(shù)前無(wú)異，且術(shù)后全部存活。多臟器組織病理切片檢查提示與Sham組比較，CLP組小鼠的肺臟、肝臟、脾臟、腸組織存在不同程度的損傷。2)脾淋巴細(xì)胞凋亡情況Sham組脾臟白髓淋巴濾泡內(nèi)出現(xiàn)少量、散在分布的凋亡淋巴細(xì)胞；CLP組脾臟白髓淋巴濾泡內(nèi)則見(jiàn)

5、大量、灶性分布的凋亡淋巴細(xì)胞。凋亡的嚴(yán)重程度以凋亡指數(shù)(ApoptosisIndex，AI)計(jì)算，CLP組與Sham組比較(P<0.01)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。3)脾組織GRP78的變化RT-PCR法檢測(cè)脾組織GRP78mRNA表達(dá)情況：Sham組和CLP組小鼠脾組織均可檢測(cè)到GRP78mRNA的表達(dá)，但CLP組小鼠脾組織GRP78mRNA相對(duì)表達(dá)水平明顯高于Sham組(P<0.05)。免疫組化與WesternBlot檢測(cè)脾組織GRP7

6、8蛋白的表達(dá)變化，表現(xiàn)為各組均有表達(dá)，但CLP組的表達(dá)量較Sham組增加(P<0.05)。4)脾組織CHOP的變化RT-PCR檢測(cè)脾組織CHOPmRNA的表達(dá)：Sham組CHOPmRNA表達(dá)較弱，而CLP組表達(dá)明顯增強(qiáng)，其相對(duì)表達(dá)水平比較P<0.05。免疫組化具有與WesternBlot相似的檢測(cè)結(jié)果：CHOP蛋白的表達(dá)量在CLP組多于Sham組(P<0.05)。 結(jié)論：1)膿毒癥脾淋巴細(xì)胞凋亡明顯增加，不僅導(dǎo)致淋巴細(xì)胞數(shù)目減少

7、，且凋亡細(xì)胞可通過(guò)造成免疫細(xì)胞無(wú)反應(yīng)或抗炎細(xì)胞因子分泌等抑制機(jī)體免疫功能，成為膿毒癥免疫抑制的重要機(jī)制。2)CLP組脾淋巴細(xì)胞GRP78mRNA和蛋白表達(dá)增加，表明膿毒癥過(guò)程中由于缺氧、氧自由基釋放及酸中毒等刺激，脾淋巴細(xì)胞啟動(dòng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)，通過(guò)上調(diào)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)伴侶蛋白GRP78表達(dá)等機(jī)制力圖糾正細(xì)胞功能紊亂。3)CLP組脾淋巴細(xì)胞CHOPmRNA和蛋白表達(dá)增加，提示內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激刺激過(guò)于強(qiáng)烈和持久，以致超過(guò)了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的代償能力，因而啟動(dòng)凋亡