EC-SOD在大鼠肝臟缺血再灌注損傷模型腎內(nèi)的表達(dá)變化.pdf

1、在肝臟移植、肝部分切除以及處理嚴(yán)重肝臟外傷時(shí)都需要暫時(shí)性阻斷肝臟血流，但當(dāng)血液供應(yīng)重新恢復(fù)時(shí)可造成肝臟的缺血再灌注損傷。其主要損傷機(jī)制之一是缺血再灌注時(shí)產(chǎn)生大量活性氧自由基(reac-tive oxygenspecies，ROS)。ROS包括超氧陰離子(O2-)、羥自由基(OH)和過氧化氫(H2O2)等。ROS化學(xué)性質(zhì)非常活潑，可以破壞細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)、DNA和脂類等生物大分子，引起細(xì)胞死亡。研究已證實(shí)腎臟是機(jī)體內(nèi)對(duì)缺血損傷最敏感的器官。

2、在肝臟血流阻斷再重新恢復(fù)的過程中，腎臟功能會(huì)受到嚴(yán)重影響。這也是導(dǎo)致臨床肝臟手術(shù)失敗的重要原因之一。此時(shí)，腎組織內(nèi)的氧化應(yīng)激水平是否也會(huì)隨之增強(qiáng)，ROS是否是導(dǎo)致腎功能損傷的重要原因？
　　超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutases， SOD)是機(jī)體內(nèi)一種重要的抗氧化酶，它能將O2-轉(zhuǎn)化成H2O2和氧，負(fù)責(zé)清除O2-。在哺乳動(dòng)物SOD共有三種亞型:Mn-SOD存在于線粒體，Cu/Zn-SOD主要位于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核。

3、細(xì)胞外超氧化物歧化酶(extracellular SOD，EC-SOD)是唯一位于細(xì)胞外的SOD亞型，并通過其肝素結(jié)合結(jié)構(gòu)域(heparin-binding domain，HBD)與細(xì)胞表面和細(xì)胞外基質(zhì)相結(jié)合。其次，EC-SOD也存在于細(xì)胞外液，如血清，腦脊髓液，腹水和滑膜液等。以往對(duì)于SOD的功能研究主要集中在Mn-SOD和Cu/Zn-SOD的抗氧化作用。但最近的研究表明EC-SOD可能具有更強(qiáng)的抗氧化應(yīng)激和抗炎作用。Ookawara

4、等人已證實(shí)EC-SOD在腎組織大量表達(dá)。EC-SOD在肝臟缺血再灌注損傷模型腎內(nèi)的表達(dá)如何變化，是否也發(fā)揮了抗氧化作用，有待證實(shí)。
　　本研究通過無損傷血管夾夾閉通往大鼠肝左葉、肝中葉的血管和膽管蒂30 min后松開血管夾，制造大鼠70％肝臟缺血再灌注損傷模型。6小時(shí)后觀察腎組織內(nèi)的MDA含量，EC-SOD mRNA水平和蛋白水平的表達(dá)變化，探討肝臟缺血再灌注損傷時(shí)腎組織內(nèi)的過氧化損傷程度和EC-SOD的抗氧化作用，為腎功能損傷的

5、防治提供一條新思路。
　　目的:觀察大鼠肝臟缺血再灌注損傷模型腎內(nèi)EC-SODmRNA水平和蛋白水平的表達(dá)變化以及腎內(nèi)的氧化應(yīng)激狀態(tài)，探討EC-SOD在氧化應(yīng)激反應(yīng)中的作用。
　　方法:
　　1.動(dòng)物分組及肝臟缺血再灌注損傷模型的制備Wister雄性大鼠12只，體重200±10g，由河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，隨機(jī)分為兩組:對(duì)照組(Con)和缺血再灌注損傷組(HIRI)，用6％水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠(5ml/kg)

6、，參照Kohli等人的方法，分離肝血管和膽管蒂，以無創(chuàng)傷性血管夾夾閉通往肝左葉、肝中葉的血管和膽管蒂。30分鐘后去掉血管夾，恢復(fù)肝臟血液供應(yīng)，制造70％肝實(shí)質(zhì)的肝臟缺血再灌注損傷模型。對(duì)照組大鼠只分離血管和膽管蒂并不夾閉。6小時(shí)后收集血液，3000rpm離心10min，分離血清，用于丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)活性、血清肌酐(Serum Creatinine，SCr)、血尿素氮(Blood UreaNitrogen，BUN)濃度測(cè)定;處死

7、大鼠取肝臟和腎臟，一部分放入4％多聚甲醛固定液內(nèi)固定，用于HE染色;將另一部分標(biāo)本放入3％多聚甲醛和1％戊二醛混合固定液中固定，用于透射電鏡觀察;將一部分腎臟標(biāo)本置于液氮中用于EC-SOD mRNA和蛋白表達(dá)水平以及MDA含量測(cè)定。
　　2.測(cè)定指標(biāo)及方法
　　2.1 血清ALT、SCr和BUN水平測(cè)定血清ALT水平由全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定;血清SCr濃度采用苦味酸法測(cè)定;血清BUN濃度采用酶偶聯(lián)速率法測(cè)定。
　　2.2

8、 HE染色觀察大鼠肝臟和腎臟的形態(tài)結(jié)構(gòu)肝臟和腎臟組織經(jīng)常規(guī)脫水、透明，石蠟包埋后，切片厚約5μm，蘇木精伊紅染色，日本產(chǎn)Olympus光學(xué)顯微鏡下觀察肝組織和腎臟的形態(tài)變化并進(jìn)行圖象分析。
　　2.3 電鏡觀察大鼠肝組織和腎組織的超微結(jié)構(gòu)變化將另一部分肝臟和腎臟標(biāo)本放入3％多聚甲醛和1％戊二醛混合固定液中固定。用于透射電鏡觀察大鼠肝組織和腎組織的超微結(jié)構(gòu)變化。
　　2.4 大鼠腎組織MDA含量測(cè)定將從-70℃冰箱中取出的腎組

9、織按照10mg/100μl加入預(yù)冷的勻漿緩沖液(50mmol/L磷酸鉀緩沖液，PH7.4，1mmol/L鹽酸苯甲脒，1mmol/LPMSF,0.1％Tween-20,0.5mol/LNaCl,1mmol/LEDTANa3,5mmol/Lβ-巰基乙醇），冰浴中勻漿，勻漿液4000rpm4℃離心20min，取上清即制成10％腎組織勻漿，腎組織勻漿內(nèi)MDA含量采用南京建成丙二醛(MDA)測(cè)定試劑盒測(cè)定。
　　2.5 大鼠腎組織EC-SO

10、D mRNA水平測(cè)定用TRIzol法提取腎內(nèi)總RNA。約3μg總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。以GAPDH為內(nèi)對(duì)照，進(jìn)行RT-PCR。分別以EC-SOD的擴(kuò)增產(chǎn)物與GAPDH灰度值之比表示目的基因的相對(duì)表達(dá)量2.6大鼠腎組織EC-SOD蛋白水平測(cè)定采用Western blot法測(cè)定大鼠腎組織EC-SOD蛋白水平。將大鼠腎組織制成勻漿，離心后取上清。用改良Lowry法進(jìn)行蛋白總量測(cè)定.電泳的蛋白上樣量為52 ug.經(jīng)過轉(zhuǎn)膜和封閉處理后，在PVD

11、F膜上加入兔抗EC-SOD抗體，室溫靜置過夜。再加入熒光標(biāo)記的抗兔IgG抗體.在雙色紅外線成像系統(tǒng)掃描照相并進(jìn)行圖像數(shù)值分析。
　　結(jié)果:
　　1.血清ALT水平Con組大鼠血清中ALT活性為20.03±5.23U/L，而HIRI組血清ALT活性為87.43±9.06 U/L。HIRI組大鼠血清ALT活性明顯高于Con組(P＜0.01)。
　　2.血清SCr水平Con組大鼠血清中SCr含量為186.57±23.07μm

12、ol/L，而HIRI組血清SCr含量為261.84±38.49μmol/L。HIRI組大鼠血清SCr含量明顯高于Con組(P＜0.05)。
　　3.血清BUN水平Con組大鼠血清中BUN含量為7.27±1.62 mmol/L，而HIRI組血清BUN含量為10.58±1.19 mmol/L。HIRI組大鼠血清BUN含量明顯高于Con組(P＜0.05)。
　　4.大鼠肝組織和腎組織的形態(tài)學(xué)改變肝臟光鏡下可見Con組大鼠肝細(xì)胞排列

13、成條索狀，圍繞中央靜脈成放射狀排列結(jié)構(gòu)正常，肝血竇大小均勻，無擴(kuò)張充血，未見異常。而HIRI組大鼠的肝組織淤血嚴(yán)重，肝血竇明顯擴(kuò)張充血，有炎細(xì)胞侵潤，肝細(xì)胞索受壓萎縮，肝細(xì)胞胞漿染色變淺且有空泡出現(xiàn)，部分肝細(xì)胞水腫明顯，細(xì)胞核染色變淺。腎組織光鏡下可見Con組大鼠腎小球、近曲小管、遠(yuǎn)曲小管及腎間質(zhì)結(jié)構(gòu)正常，未見組織細(xì)胞有水腫及變性壞死等現(xiàn)象;HIRI組大鼠的腎組織有充血現(xiàn)象，近曲小管上皮細(xì)胞水腫明顯，可見空泡樣變性，細(xì)胞漿及細(xì)胞核染色變

14、淺，部分腎小球萎縮、腎小囊擴(kuò)張。
　　5.大鼠肝組織和腎組織的超微結(jié)構(gòu)改變Con組大鼠肝組織電鏡下可見細(xì)胞核、線粒體、粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等結(jié)構(gòu)完整、清晰無異常;HIRI組大鼠的肝組織細(xì)胞膜不完整、結(jié)構(gòu)模糊、細(xì)胞間連接消失、壞死，線粒體只看到模糊影像、線粒體嵴消失結(jié)構(gòu)無法辨認(rèn)，細(xì)胞核及內(nèi)部染色質(zhì)結(jié)構(gòu)模糊，細(xì)胞內(nèi)可見空泡，肝細(xì)胞呈現(xiàn)變性壞死的表現(xiàn)。Con組大鼠腎組織電鏡下可見腎小球?yàn)V過膜結(jié)構(gòu)清晰完整，腎小管結(jié)構(gòu)正常;HIRI組大鼠的腎組織電鏡

15、下可見腎小球內(nèi)有脫落的內(nèi)皮細(xì)胞核，間隙增大變寬，腎小管上皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)疏松有空泡樣變性。
　　6.腎勻漿內(nèi)MDA的含量Con組大鼠腎勻漿內(nèi)的MDA含量為7.79±1.48mmol/g，而HIRI組腎勻漿內(nèi)的MDA含量為13.02±2.37 mmol/g。HIRI組大鼠腎勻漿內(nèi)的MDA含量明顯高于Con組(P＜0.01)。
　　7.腎組織EC-SOD mRNA的相對(duì)表達(dá)量采用RT-PCR的方法測(cè)定大鼠腎組織內(nèi)EC-SOD mRNA

16、的相對(duì)表達(dá)量。Con組腎組織內(nèi)EC-SOD mRNA的相對(duì)表達(dá)量為0.86±0.17，HIRI腎組織內(nèi)EC-SOD mRNA的相對(duì)表達(dá)量為1.37±0.11，HIRI組大鼠腎組織內(nèi)EC-SOD mRNA水平明顯高于Con組(P＜0.01)。說明HIRI組大鼠腎組織內(nèi)EC-SOD的基因表達(dá)水平升高。
　　8.大鼠腎組織EC-SOD蛋白水平Con組大鼠腎組織內(nèi)EC-SOD的蛋白表達(dá)水平為0.58±0.14，HIRI組大鼠腎組織內(nèi)EC-

17、SOD的蛋白表達(dá)水平為0.95±0.14。HIRI組EC-SOD蛋白水平明顯高于對(duì)照組(P＜0.01)。說明HIRI組大鼠腎組織內(nèi)EC-SOD的蛋白表達(dá)水平升高。
　　結(jié)論:
　　1.結(jié)扎肝左、中血管和膽管蒂30分鐘，恢復(fù)血供6小時(shí)，可成功建立大鼠70％肝臟缺血再灌注損傷模型。
　　2.肝臟缺血再灌注損傷可累及腎臟，致使其形態(tài)結(jié)構(gòu)和功能受損。
　　3.EC-SOD的基因和蛋白表達(dá)水平在HIRI模型組腎組織中均明顯