組蛋白去乙?；敢种苿┣乓志谹抑制結(jié)腸癌細胞生長作用機制研究.pdf

1、結(jié)腸癌是常見的惡性腫瘤,在西方國家發(fā)病率(50/10萬)與死亡率位居惡性腫瘤的前3位;在亞洲,結(jié)腸癌的發(fā)病率呈逐年上升趨勢;在我國,結(jié)腸癌的發(fā)病率僅次于胃癌、肺癌和食道癌,排名第4位,患者5年中位生存率不足40％。研究資料顯示,我國結(jié)腸癌的發(fā)病率與死亡率將在今后很長一段時間內(nèi)呈快速上升趨勢,將成為常見而高發(fā)的惡性腫瘤。因此,深入探究結(jié)腸癌的發(fā)病機制,尋找有效的化學治療藥物己成為抗結(jié)腸癌研究重要而緊迫的任務。目前,普遍認為結(jié)腸癌發(fā)病是一個

2、多基因、多環(huán)節(jié)的復雜過程,其中涉及多個癌基因激活和抑癌基因失活。p53是一個重要的抑癌基因,它主要通過調(diào)控下游基因發(fā)揮作用。p53蛋白可以促進p21和Bax基因的表達,引起細胞周期阻滯和凋亡發(fā)生。很多抗腫瘤藥物通過p53依賴途徑發(fā)揮作用,但是臨床研究發(fā)現(xiàn),有接近50%的腫瘤患者存在p53突變以及其功能缺失。曲古抑菌素A(TrichostatinA,TSA)是一種強效、特異而可逆的組蛋白去乙?；敢种苿?可以抑制多種腫瘤細胞生長,誘導細胞

3、周期阻滯,促進細胞分化及細胞凋亡。盡管國內(nèi)外對TSA的抗腫瘤作用已經(jīng)進行了一些研究,但其抗腫瘤的作用機制仍然有待進一步闡明。本課題通過觀察TSA對HCT116p53(+/+)和HCT116p53(-/-)結(jié)腸癌細胞,以及p53突變型結(jié)腸癌HT29細胞的細胞周期和細胞凋亡的作用,同時分析TSA對與細胞凋亡密切相關(guān)分子PAPP,caspase3、Bax、Bcl-2、Bcl-xL、MCL1和Ku70的調(diào)控作用,深入探究TSA引起細胞周期阻滯,

4、誘導細胞凋亡的機制。本課題的研究,將進一步豐富TSA的抗腫瘤作用機制,并為組蛋白去乙?；敢种苿┯糜诮Y(jié)腸癌的化學預防和治療提供理論依據(jù)。
　　目的:1.觀察TSA對細胞周期、對細胞凋亡的影響,探討p53依賴、非依賴途徑在TSA引起細胞周期阻滯和細胞凋亡中的作用。2.通過檢測TSA對Bax啟動子活性的調(diào)控作用和對細胞凋亡相關(guān)分子PAPP、caspase3、Bax、Bcl-2、Bcl-xL、MCL1表達及線粒體膜電位的影響,深入探究T

5、SA誘導結(jié)腸癌細胞凋亡的機制;3.通過檢測TSA對Ku70乙?；约癇ax轉(zhuǎn)位的影響,闡明Ku70乙?；赥SA誘導的結(jié)腸癌細胞凋亡中的作用。
　　方法:實驗一以HCT116p53(+/+)、HCT116p53(-/-)細胞及突變型p53基因的HT29細胞為研究對象,經(jīng)過不同濃度(0、0.1、1、5μM)的TSA處理24h后,采用流式細胞儀測定細胞周期分布和細胞凋亡;啟動子實驗檢測TSA對p21活性的影響;Westernblott

6、ing分析TSA對乙?；痯53和p21蛋白表達的影響。實驗二以表達野生型p53基因的HCT116細胞的和突變型p53基因的HT29為研究對象,分別用不濃度(0、0.1、1、5μM)的TSA處理,以流式細胞儀和Westernblotting檢測細胞凋亡;采用Mitotracker染料觀察活細胞線粒體膜電位變化;Westernblotting方法檢測細胞凋亡相關(guān)分子PAPP、caspase-3、Bax、Bcl-2、Bcl-xL和MCL1的表

7、達;啟動子實驗檢測TSA對Bax活性的影響;BaxsiRNA技術(shù)檢測Bax表達水平和PARP剪切情況。實驗三以表達野生型p53基因的HCT116細胞的和突變型p53基因的HT29細胞為研究對象,給予不同濃度(0、0.1、1、5μM)的TSA處理,采用免疫熒光染色法觀察在不同的時間點(0h、1h、4h、18h)Ku70分布的變化;IP-Westernblotting方法檢測TSA對Ku70乙?；淖饔?Westernblotting方法檢

8、測經(jīng)TSA處理6h和18h后胞漿中和線粒體中Bax表達量的變化;Ku70siRNA技術(shù)檢測Bax表達水平和PARP剪切情況。
　　結(jié)果:實驗一1.TSA可濃度依賴性地誘導HCT116p53(+/+)、HCT116p53(-/-)細胞及突變型p53的HT29細胞發(fā)生G2/M周期阻滯。2.TSA可濃度依賴性地增加p53陽性HCT116細胞的乙?；痯53和p21蛋白表達,同時促進p21啟動子的活性;而TSA對p53陰性的HCT116細胞

9、的乙?；痯53和p21蛋白表達及p21啟動子激活無明顯影響。3.TSA可濃度依賴性誘導結(jié)腸癌細胞凋亡,p53陽性細胞凋亡率顯著大于p53陰性細胞。實驗二1.TSA濃度依賴性誘導HCT116和HT29細胞凋亡,其中HCT116細胞凋亡率顯著高于HT29細胞。2.TSA可濃度依賴性地降低兩種細胞線粒體膜電位,同時濃度依賴性激活caspase-3。3.兩株細胞經(jīng)TSA處理后,Bax蛋白的表達均顯著性增加而Bcl-2和Bcl-xL的表達均顯著性

10、減少,且呈濃度依賴性;TSA對兩株細胞中MCL1蛋白表達均無顯著性影響。4.p53陽性和陰性HCT116細胞經(jīng)TSA處理后,其Bax的轉(zhuǎn)錄活性均濃度依賴性增高。5.p53野生型和突變型細胞經(jīng)TSA處理后,Bax表達量和PARP剪切片段顯著性增加;用BaxsiRNA使Bax表達下調(diào)后,PARP剪切片段顯著性減少,表明細胞凋亡減少。實驗三1.TSA處理HCT116細胞和HT29細胞1h后,部分Ku70由胞核向胞漿轉(zhuǎn)位;4h開始再向細胞核中分

11、布,到18h,胞漿中仍有少量Ku70,HCT116胞漿中的少量Ku70形成顆粒狀。2.兩株細胞經(jīng)TSA處理后,乙?；疜u70表達均顯著性增加。3.兩株細胞在TSA處理6h后,胞漿中Bax表達顯著性減少而線粒體中表達顯著性增加;18h后這種趨勢更加明顯;細胞色素C的表達與Bax恰好相反。4.用Ku70siRNA使兩株細胞中的Ku70表達下調(diào)后,經(jīng)TSA處理,Ku70、Bax表達量及PARP剪切片段均顯著性減少。
　　結(jié)論:1.TSA