玻璃化冷凍人類(lèi)卵母細(xì)胞及囊胚的安全性研究.pdf

1、至今玻璃化冷凍人類(lèi)不同狀態(tài)卵母細(xì)胞及囊胚出生的嬰兒全世界已經(jīng)有一千多例,但是由于對(duì)出生嬰兒缺乏終生追蹤資料及對(duì)細(xì)胞凍融過(guò)程中發(fā)生的變化缺乏全面了解,目前還有許多問(wèn)題尚未解決,其臨床有效性和安全性仍是人們關(guān)注的焦點(diǎn)。本文就目前尚未解決的問(wèn)題從以下四個(gè)方面進(jìn)行了研究,從基礎(chǔ)到臨床系統(tǒng)評(píng)價(jià)玻璃化冷凍人類(lèi)卵母細(xì)胞及囊胚的安全性,旨在為臨床應(yīng)用提供有利的理論和臨床依據(jù),目前國(guó)內(nèi)外尚未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。
　　 第-部分玻璃化冷凍小鼠成熟卵母細(xì)胞的

2、基礎(chǔ)研究
　　 目的:
　　 尋找冷凍小鼠成熟卵母細(xì)胞最低濃度的乙二醇(Ethylene glycol,EG)和最佳冷凍時(shí)機(jī),探討其可能的機(jī)制。
　　 方法：
　　 1.不同濃度EG玻璃化冷凍小鼠成熟卵母細(xì)胞。隨機(jī)分7組,分別經(jīng)一步、兩步、三步法5％EG與10％EG冷凍。隨機(jī)分5組,分別經(jīng)不同溫度、時(shí)間及蔗糖濃度的10％EG冷凍。隨機(jī)分4組,分別經(jīng)兩步法10％EG、15％EG及20％EG冷凍。凍存1個(gè)月后

3、解凍,存活的卵母細(xì)胞孵育2h后行(Intracytoplasmic sperminjection,ICSI)受精,觀察受精、卵裂及胚胎發(fā)育情況。
　　 2.小鼠成熟卵母細(xì)胞按取卵后不同冷凍時(shí)間隨機(jī)分3組,Polscope成像系統(tǒng)觀察并測(cè)量紡錘體密度(用阻滯值Retardance值表示)、極體與紡錘體角度。入選標(biāo)準(zhǔn):選擇冷凍-解凍后均有紡錘體的卵母細(xì)胞進(jìn)行冷凍前后各值的測(cè)量及ICSI受精。
　　 結(jié)果：
　　 1.

4、不同濃度EG對(duì)小鼠成熟卵母細(xì)胞復(fù)蘇結(jié)局的影響。三組5％EG的復(fù)蘇率均為0；三組10％EG之間的存活率、囊胚率比較均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05),但是均明顯低于對(duì)照組(P<0.01,P<0.05)。五組間的存活率、受精率、卵裂率及優(yōu)質(zhì)胚胎率比較,均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。組1與組3的存活率均明顯低于組2和對(duì)照組(P<0.01)。
　　 2.解凍后極體與紡錘體的角度均大于冷凍前(P<0.01)；B組和C組解凍后紡錘體的Reta

5、rdance值均低于冷凍前(P<0.05),而A組則相反。B組冷凍前紡錘體的Retardance值顯著高于其它兩組(P<0.05),而A組解凍后紡錘體的Retardance值、存活率和卵裂率均明顯高于其它兩組(P<0.05,P<0.01)。
　　 結(jié)論：
　　 1.兩步法15％EG及取卵后2h是玻璃化冷凍小鼠成熟卵母細(xì)胞中冷凍效果最佳的濃度和時(shí)機(jī)。
　　 2.新鮮小鼠成熟卵母細(xì)胞的紡錘體變化有時(shí)間依賴性；凍融卵母

6、細(xì)胞的質(zhì)量與解凍后紡錘體密度呈正相關(guān),與極體與紡錘體角度無(wú)相關(guān)性。
　　 第二部分玻璃化冷凍人類(lèi)不同狀態(tài)卵母細(xì)胞的安全陛研究
　　 目的:
　　 探討玻璃化冷凍安全性最高的人類(lèi)卵母細(xì)胞及可能的機(jī)制。
　　 方法：
　　 1.按體外成熟時(shí)間分為:18h體外成熟組(A組)；24h體外成熟組(B組)；48h體外成熟組(C組)。
　　 2.按不同成熟階段分為:GV組(Germinal vesicl

7、e,GV)和MI組(MetaphaseI,MI)。
　　 3.按不同狀態(tài)分為:體內(nèi)成熟組；體外成熟組；未成熟組。
　　 以上三組實(shí)驗(yàn)均通過(guò)Polscope成像系統(tǒng)觀察并測(cè)量冷凍前后紡錘體密度、極體與紡錘體角度及透明帶內(nèi)層厚度(Zona pellucida thickness,ZPT)和密度(Zona pellucida density,ZPD),并進(jìn)行胚胎發(fā)育評(píng)估。其中第3組實(shí)驗(yàn)的胚胎進(jìn)一步采用熒光原位雜交法進(jìn)行染色體非

8、整倍體的篩查。
　　 4.采用單細(xì)胞凝膠電泳試驗(yàn)檢測(cè)不同狀態(tài)卵母細(xì)胞凍融后的DNA損傷,分為:體內(nèi)成熟組,體外成熟組,未成熟組。
　　 結(jié)果：
　　 1.三組解凍后極體與紡錘體的角度、透明帶內(nèi)層ZPD值均大于冷凍前,前者B組有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05),后者C組有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。B組與C組解凍后紡錘體的Retardance值均低于冷凍前(P<0.05)。冷凍前紡錘體的Retardance值B組顯著高于

9、其它兩組(P<0.05),而解凍后A組紡錘體的Retardance值及優(yōu)質(zhì)胚胎率、囊胚形成率均高于其它兩組(P<0.01,P<0.05)。
　　 2.冷凍GV組的存活率顯著高于冷凍MI組(P<0.05),而前者的體外成熟率顯著低于后者(P<0.01)；兩冷凍組解凍后透明帶內(nèi)層ZPD值高于冷凍前(P<0.05)。
　　 3.兩成熟組解凍后極體與紡錘體角度、紡錘體的Retardance值均大于冷凍前,前者體內(nèi)成熟組有統(tǒng)計(jì)學(xué)差

10、異(P<0.05),后者體外成熟組有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)；三組解凍后透明帶內(nèi)層ZPD均顯著高于冷凍前(P<0.05)。未成熟組解凍后紡錘體率、紡錘體的Retardance值及卵裂率均顯著低于其它兩組(P<0.05)。三組胚胎的非整倍體率無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。
　　 4.體內(nèi)成熟組彗星細(xì)胞率顯著低于其它兩組(P<0.01)；未成熟組彗星細(xì)胞拖尾長(zhǎng)度顯著高于其它兩組(P<0.05)。
　　 結(jié)論：
　　

11、 1.凍融人類(lèi)不同狀態(tài)卵母細(xì)胞的質(zhì)量與解凍后紡錘體密度呈正相關(guān),與透明帶內(nèi)層ZPT和ZPD、極體與紡錘體角度無(wú)相關(guān)性。建議臨床選擇解凍后紡錘體密度高的卵母細(xì)胞形成的胚胎進(jìn)行移植。
　　 2.本研究證實(shí)玻璃化冷凍沒(méi)有增加凍融卵母細(xì)胞胚胎染色體的非整倍體率,但是Polscope觀察凍融人類(lèi)卵母細(xì)胞紡錘體出現(xiàn)率及密度不能預(yù)測(cè)其胚胎非整倍體的發(fā)生,尚需產(chǎn)前診斷進(jìn)一步評(píng)估胎兒的安全性。
　　 3.人類(lèi)體外成熟卵母細(xì)胞的紡錘體變化有

12、時(shí)間依賴性。冷凍18h體外成熟卵母細(xì)優(yōu)于24h和48h體外成熟卵母細(xì)胞。冷凍MI期與GV期卵母細(xì)胞發(fā)育潛能無(wú)明顯差異。
　　 4.玻璃化冷凍人類(lèi)體內(nèi)成熟卵母細(xì)胞的安全性最高。其次冷凍體外成熟卵母細(xì)胞優(yōu)于未成熟卵母細(xì)胞,后者胚胎發(fā)育潛能低的因?yàn)榭赡芘cDNA損傷最大有關(guān)。但是本研究中體內(nèi)成熟的卵母細(xì)胞樣本量較小,尚需加大樣本量證實(shí)。
　　 第三部分玻璃化冷凍人類(lèi)成熟卵母細(xì)胞的臨床結(jié)局
　　 目的:
　　 探討

13、不同冷凍時(shí)機(jī)及解凍方法與妊娠結(jié)局的關(guān)系和臨床應(yīng)用的安全性。
　　 方法：
　　 回顧性分析本中心2007.7～2009.5接受成熟卵母細(xì)胞冷凍-解凍的30例不孕癥患者的一般臨床資料,追蹤隨訪妊娠結(jié)局及胎兒出生情況。所有患者分三組:取卵后4-5h冷凍且常規(guī)法解凍(A組)；取卵后2h冷凍且常規(guī)法解凍(B組)；取卵后2h冷凍且改良法解凍(C組)。
　　 結(jié)果：
　　 1.臨床資料各值的比較,均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>

14、0.05)。
　　 2.B組和C組的卵母細(xì)胞存活數(shù)、移植周期率均明顯高于A組(P<0.01,P<0.05)。C組的胚胎種植率、臨床妊娠率均明顯高于B組(P<0.01,P<0.05)。
　　 3.B組1例臨床妊娠2個(gè)月后胚胎停止發(fā)育。C組9例臨床妊娠(包括3例贈(zèng)卵移植,5例供精移植,1例自身移植),其中1例贈(zèng)卵移植在孕4個(gè)月晚期流產(chǎn)。8例已順利分娩五男嬰四女?huà)?染色體及發(fā)育均正常,每解凍卵母細(xì)胞活產(chǎn)率5.9％(8/135)

15、。
　　 4.C組中用于自體、贈(zèng)卵及供精移植的平均年齡、存活卵母細(xì)胞數(shù),受精率、胚胎種植、臨床妊娠率之間比較,均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。
　　 結(jié)論：
　　 1.取卵后2h冷凍及改良解凍方法是提高玻璃化冷凍成熟卵母細(xì)胞臨床妊娠的關(guān)鍵,可以成功應(yīng)用于臨床贈(zèng)卵、供精及自體移植。
　　 2.目前本中心已經(jīng)有8例妊娠順利分娩健康嬰兒,經(jīng)檢索為河南省首例冷凍卵母細(xì)胞出生嬰兒,證實(shí)此項(xiàng)技術(shù)的安全性及有廣闊的應(yīng)用

16、前景:是進(jìn)行長(zhǎng)期贈(zèng)卵的一項(xiàng)較好方案;是睪丸取精失敗患者的有效補(bǔ)救措施。
　　 第四部分玻璃化冷凍人類(lèi)不同階段囊胚的初步研究
　　 目的:
　　 探討玻璃化冷凍人類(lèi)囊胚的最佳階段和方法。
　　 方法：
　　 選取本中心2009.9～2010.2行IVF/ICSI的患者因質(zhì)量差或異常受精的廢棄胚胎,繼續(xù)培養(yǎng)至不同發(fā)育階段質(zhì)量較好的囊胚。將早期囊胚和擴(kuò)張期囊胚隨機(jī)分為:穿刺組、未穿刺組和對(duì)照組。解凍后囊

17、胚孵育2h、12h及16h觀察并記錄各組囊胚的復(fù)蘇、重新擴(kuò)張及孵出結(jié)果。TUNEL進(jìn)一步檢測(cè)囊胚細(xì)胞凋亡情況。
　　 結(jié)果：
　　 1.早期囊胚穿刺組與未穿刺組的囊胚擴(kuò)張率、囊胚孵出率均明顯低于,且凋亡細(xì)胞數(shù)明顯高于對(duì)照組(P<0.01,P<0.01,P<0.05)。
　　 2.擴(kuò)張期囊胚穿刺組的囊胚復(fù)蘇率明顯高于未穿刺組(P<0.01),穿刺組與對(duì)照組的囊胚擴(kuò)張率明顯高手,且凋亡細(xì)胞數(shù)明顯低于未穿刺組(P<0.