三聚氰胺及三聚氰酸誘導(dǎo)大鼠腎臟損害及結(jié)石的研究.pdf

1、研究背景：
　　 研究顯示2007年3月美國(guó)大量寵物中毒發(fā)生急性腎衰事件,是由于寵物食物中混有8.4％的三聚氰胺和5.3％三聚氰酸；而導(dǎo)致我國(guó)2008年9月因服用“問(wèn)題奶粉”出現(xiàn)近30萬(wàn)嬰幼兒發(fā)生泌尿系結(jié)石及泌尿系異常的因?yàn)閯t是“問(wèn)題奶粉”中含有大量濃度不等的三聚氰胺。研究二者誘導(dǎo)腎臟損害及泌尿系結(jié)石的病理過(guò)程和發(fā)病機(jī)制,尋找預(yù)防和治療此類腎臟損害和結(jié)石的有效方法,是目前國(guó)內(nèi)外專家們急需積極研究的熱點(diǎn)方向。
　　 既往研

2、究顯示三聚氰胺和三聚氰酸在哺乳動(dòng)物體內(nèi)屬于惰性代謝,即在體內(nèi)不會(huì)被轉(zhuǎn)化,亦不會(huì)蓄積體內(nèi),均以原型從尿液中排出。其中三聚氰胺在體內(nèi)的半衰期約為2.7h,三聚氰酸為2.5h,因此泌尿系統(tǒng)容易成為三聚氰胺與三聚氰酸損害的靶器官。國(guó)外的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)顯示長(zhǎng)期單獨(dú)大劑量攝入三聚氰胺或三聚氰酸導(dǎo)致膀胱癌、膀胱結(jié)石、腎小管上皮增生、擴(kuò)張及腎纖維化等。而2008年Dobson等人的研究證實(shí)了三聚氰胺和三聚氰酸同時(shí)混合攝入導(dǎo)致大鼠急性腎衰竭而死亡,且病理解剖提

3、示腎小管堵塞了大量結(jié)晶,同時(shí)發(fā)現(xiàn)其他器官未受明顯影響,并通過(guò)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)腎組織中的結(jié)晶是三聚氰胺和三聚氰酸1:1結(jié)合的晶體。另外Dobson等人的研究還證明了單獨(dú)攝入三聚氰胺或三聚氰酸并未對(duì)大鼠腎臟造成損害,而且三聚氰胺或三聚氰酸在體內(nèi)所能達(dá)到的濃度限制內(nèi)是不會(huì)對(duì)腎臟細(xì)胞造成毒性作用的。目前同系物三聚氰酸二酰胺和三聚氰酸一酰胺尚無(wú)致腎損害及結(jié)石的數(shù)據(jù)。
　　 由于三聚氰胺含氮量較高,因而被非法添加到寵物飼料、牛奶以及其它蛋自制品中以

4、虛假提高蛋白含量。然而純度不高的三聚氰胺往往混雜有三聚氰酸,或者在食品加工過(guò)程中三聚氰胺可以少量轉(zhuǎn)化成三聚氰酸。我國(guó)“問(wèn)題奶粉”事件后質(zhì)檢總局隨后在全國(guó)開(kāi)展了嬰幼兒奶粉專項(xiàng)檢查,其中在某品牌奶粉中檢測(cè)出三聚氰胺含量高達(dá)2563mg/kg,但未報(bào)道檢測(cè)出三聚氰酸。此外,北京大學(xué)一附院的研究發(fā)現(xiàn)暴露在三聚氰胺的患兒泌尿系結(jié)石發(fā)病率比正常嬰幼兒高出7倍,北京兒童醫(yī)院分析出“問(wèn)題奶粉”患兒結(jié)石成分為“三聚氰胺和尿酸”,所以目前國(guó)內(nèi)一直認(rèn)為是三聚

5、氰胺與尿酸造成嬰幼兒發(fā)生腎結(jié)石。
　　 急性腎衰(ARF)的發(fā)病機(jī)制主要分為腎前性、腎性和腎后性,而三聚氰胺和三聚氰酸被證明無(wú)直接腎毒性,其對(duì)腎臟損害的主要因?yàn)榭赡苁悄I后性梗阻引起的ARF。泌尿系結(jié)石的種類和發(fā)病機(jī)制十分復(fù)雜,而目前研究證明與三聚氰胺相關(guān)的結(jié)石很可能與尿酸一類結(jié)石相關(guān),這可能與三嗪類化合物影響體內(nèi)代謝,以及其分子結(jié)構(gòu)更易誘導(dǎo)尿酸的趨向附生而形成結(jié)石有關(guān),故需要研究三聚氰胺和三聚氰酸對(duì)尿酸排泄量、尿PH值、尿量等誘

6、發(fā)尿酸結(jié)石的關(guān)鍵因素的影響。
　　 “問(wèn)題奶粉”對(duì)泌尿系損害機(jī)制尚未完全明確,基于受檢測(cè)的問(wèn)題奶粉中含三聚氰胺最高劑量為2563mg/kg,再根據(jù)嬰兒最小平均體重(6kg)、平均每日攝入奶粉量(150g)及大鼠與人體藥理?yè)Q算公式(約6.3:1),我們計(jì)算出復(fù)制大鼠模型每天應(yīng)攝入最大三聚氰胺劑量約為403.7 mg/kg。同時(shí)參考國(guó)外的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)劑量,設(shè)計(jì)了本實(shí)驗(yàn)給藥劑量進(jìn)行研究。本實(shí)驗(yàn)采用三聚氰胺和三聚氰酸單獨(dú)及聯(lián)合灌胃給藥方法,

7、建立大鼠腎臟損害模型進(jìn)行研究,旨在探明三聚氰胺及其同系物三聚氰酸對(duì)腎臟損害和誘發(fā)結(jié)石的機(jī)制,為進(jìn)一步尋求防治方法提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　 研究目的:
　　 1、探討單獨(dú)的三聚氰胺或三聚氰酸對(duì)大鼠腎臟損害及誘發(fā)泌尿系結(jié)石的機(jī)制,并分析結(jié)石晶體成分。
　　 2、探討三聚氰胺和三聚氰酸的聯(lián)合效應(yīng)損害大鼠腎臟及誘發(fā)泌尿系結(jié)石的機(jī)制,并分析結(jié)石晶體成分。
　　 3、通過(guò)大鼠的實(shí)驗(yàn)研究來(lái)探討“問(wèn)題奶粉”致嬰幼兒泌尿系結(jié)石

8、的可能機(jī)制。
　　 研究方法:
　　 1、制作模型和分組
　　 將60只SD大鼠隨機(jī)分成A組(空白對(duì)照組)、B組(三聚氰胺400mg·kg-1·d-1)、C組(三聚氰酸400mg·kg-1·d-1)、D組(三聚氰胺400mg·kg-1·d-1+三聚氰酸400mg·kg-1·d-1)、E組(三聚氰胺30mg·kg-1·d-1+三聚氰酸30mg·kg-1·d-1),每組12只,通過(guò)灌胃給藥。
　　 2、指標(biāo)的

9、收集和檢測(cè)
　　 用代謝籠收集前3天24小時(shí)尿液,進(jìn)行24小時(shí)尿量、PH值和24小時(shí)尿酸排泄量測(cè)量及尿沉渣涂片檢查；分別于第4天、第31天灌胃前每組采集6只大鼠的血液標(biāo)本檢測(cè)血肌酐、尿素氮、尿酸；取雙側(cè)腎臟用外科顯微鏡觀察后,制作快速冰凍切片及石蠟切片(HE染色)觀察腎臟病理改變及晶體形成。腎臟冰凍組織切成5μm薄片后,用紅外顯微光譜儀檢測(cè)晶體成分。
　　 3、采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,數(shù)據(jù)以(x)±s

10、表示。尿液數(shù)據(jù)和血液數(shù)據(jù)分別采用重復(fù)測(cè)量方差分析和析因方差分析。當(dāng)P<0.05時(shí),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)果:
　　 1、尿液和血液生化結(jié)果
　　 與A組比較,B組和C組大鼠的24h尿尿量、24h尿酸排泄量均明顯增多,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；而D、E組尿量明顯減少、PH值降低、24h尿酸排泄量明顯減少,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),其中D組變化比E組更為明顯,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)

11、。在相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)各組與A組比較,B組和C組的血肌酐、血尿酸及血尿素氮均升高,但在第4天時(shí)候僅血尿素氮差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),而第31天血尿素氮及血尿酸差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)； D組在第4天的時(shí)候各項(xiàng)指標(biāo)均顯著升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；E組第4天血肌酐及血尿素氮明顯升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),第31天則各項(xiàng)指標(biāo)明顯升高,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。其中D組比E組變化更為明顯,差異有統(tǒng)計(jì)

12、學(xué)意義(P<0.05),同時(shí)E組各項(xiàng)指標(biāo)第31天比第4天顯著升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。(見(jiàn)表2)
　　 2、尿沉渣涂片
　　 從尿沉渣涂片中可見(jiàn):A組尿液無(wú)明顯晶體；B組可見(jiàn)疑似三聚氰胺原型的晶體；C組無(wú)明顯晶體,但有少許細(xì)沙樣小顆粒沉淀物；D組及E組均可見(jiàn)淡黃色圓形特異性晶體。
　　 3、腎臟病理改變
　　 大體標(biāo)本:A組大鼠腎臟包膜光滑暗紅色,腎臟解剖觀察無(wú)明顯病理改變。B、C組大鼠腎臟

13、皮髓結(jié)構(gòu)清晰,腎盞及腎盂良好,未見(jiàn)結(jié)石晶體沉積。D組大鼠腎臟明顯腫大,外觀呈灰黃色,包膜有許多散在黃色斑點(diǎn),腎臟皮質(zhì)變薄,腎盞、腎盂結(jié)構(gòu)破壞,腎內(nèi)布滿淡黃色結(jié)石晶體。E組第4天皮髓結(jié)構(gòu)尚清晰,可見(jiàn)不少淡黃色結(jié)石晶體沉積；第31天E組大鼠腎臟剖面呈紅褐色,皮髓變模糊,大量淡黃色顆粒沉積。各組大鼠膀胱均未見(jiàn)觀察到結(jié)石。
　　 腎組織切片:A組大鼠未見(jiàn)明顯病理改變。B組及C組腎組織石蠟切片與冰凍切片在第4天的時(shí)候均未見(jiàn)結(jié)晶及明顯病理改

14、變；第31天亦未見(jiàn)晶體,僅見(jiàn)少量腎小管輕度擴(kuò)張、上皮細(xì)胞腫脹和少量管型形成等。D組與E組腎組織石蠟切片與冰凍切片均可見(jiàn)淡黃色、呈放射狀的同心圓形晶體,主要集聚于腎小管,也見(jiàn)于集合管、間質(zhì)及被膜下,偶見(jiàn)于腎小球囊中,大多晶體以不規(guī)則碎片出現(xiàn)于腎小管中。此外,腎小管濁腫、上皮受損,并有各種管型形成,大量炎性細(xì)胞在腎小球囊腔、腎小管及間質(zhì)中:E組第31天還可看到許多纖維細(xì)胞充滿間質(zhì)。此外第4天D組切片單倍視野下結(jié)石晶體數(shù)量和體積,以及組織病理

15、變化都大于E組；而第31天E組結(jié)石晶體數(shù)量、體積以及組織病理變化都比其在第4天觀察到的要大。
　　 4、腎組織晶體成分分析結(jié)果
　　 對(duì)混合組大鼠腎臟出現(xiàn)的各種形態(tài)結(jié)石晶體進(jìn)行紅外顯微光譜分析,得到基本一致的紅外光譜圖；根據(jù)專業(yè)分析,及查閱相關(guān)文獻(xiàn)可知混合藥物組大鼠在腎臟生成的晶體即為三聚氰胺氰尿酸鹽晶體。
　　 結(jié)論:
　　 1、三聚氰胺和三聚氰酸同時(shí)混合進(jìn)入體內(nèi),會(huì)在腎臟形成一種不溶于水的三聚氰胺氰尿

16、酸鹽晶體,此晶體能堵塞腎小管造成腎臟損害甚至急性腎衰竭,并可以作為結(jié)石核心與尿酸等成分一起誘發(fā)泌尿系結(jié)石；
　　 2、三聚氰胺與其同系物三聚氰酸對(duì)腎臟的損害較輕,機(jī)制相似；單獨(dú)攝入三聚氰胺或三聚氰酸,大鼠腎臟無(wú)結(jié)石晶體形成,但長(zhǎng)期攝入會(huì)對(duì)腎功能造成損害,其因?yàn)闉殚L(zhǎng)期的滲透性利尿?qū)е挛锢硇該p傷腎組織；
　　 3、三聚氰胺與三聚氰酸的聯(lián)合效應(yīng)比它們的單獨(dú)效應(yīng)對(duì)腎臟的損害作用更大,更容易誘發(fā)泌尿系尿酸結(jié)石；其聯(lián)合效應(yīng)與聯(lián)合藥物