RNAi在胰腺癌基因治療中的交叉抑制性效果研究.pdf

1、目的：構(gòu)建表達(dá)短發(fā)卡RNA(shRNA)的質(zhì)粒載體，觀察其在K-ras基因突變類型為GAT和GTT的人胰腺癌細(xì)胞株P(guān)ANC-1和CFPAC-1間的交叉抑制效果，為RNAi技術(shù)應(yīng)用于治療胰腺癌奠定一定的理論和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。 方法： 1、針對(duì)GAT和GTT兩種K-ras基因突變類型，分別設(shè)計(jì)兩條shRNA序列，并分別加載到質(zhì)粒載體pGenesil-1上，構(gòu)建針對(duì)人胰腺癌細(xì)胞株P(guān)ANC-1和CFPAC-1的K-ras基因的質(zhì)粒pG

2、enesil-1GAT和pGenesil-1GTT。 2、應(yīng)用質(zhì)粒pGenesil-1GAT和pGenesil-1GTT瞬時(shí)轉(zhuǎn)染K-ras突變類型為GAT的人胰腺癌細(xì)胞株P(guān)CNA-1，同時(shí)將質(zhì)粒pGenesil-1GAT和pGenesil-1GTT瞬時(shí)轉(zhuǎn)染具有K-ras突變類型為GTT的人胰腺癌細(xì)胞株CFPAC-1。每種細(xì)胞分4組，分別為特異性抑制組，交叉性抑制組，空白質(zhì)粒組和對(duì)照組，其中特異性抑制組轉(zhuǎn)染同細(xì)胞K-ras基因突變

3、類型相同的質(zhì)粒，交叉性抑制組轉(zhuǎn)染與其K-ras基因突變類型不同的質(zhì)粒，空白對(duì)照組轉(zhuǎn)染空白質(zhì)粒pGenesil-1KB，對(duì)照組以1×PBS轉(zhuǎn)染作為對(duì)照。用逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)和免疫印跡法(Western-blot)方法檢測(cè)轉(zhuǎn)染后細(xì)胞K-ras基因的表達(dá)情況，并采用CCK-8(ceIl counring kit-8)活細(xì)胞計(jì)數(shù)法，繪制轉(zhuǎn)染前后細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線，以檢測(cè)質(zhì)粒pGenesil-1GAT對(duì)胰腺癌細(xì)胞PANC-1的K-r

4、as基因的抑制效果和質(zhì)粒pGenesil-1GTT對(duì)PANC-1細(xì)胞的交叉抑制效果，以及質(zhì)粒pGenesil-1GTT對(duì)胰腺癌細(xì)胞CFPAC-1的K-ras基因的抑制效果和質(zhì)粒pGenesil-1GTT對(duì)CFPAC-1細(xì)胞的交叉抑制效果。 結(jié)果： 1、通過(guò)酶切鑒定和送檢基因測(cè)序證實(shí)插入shRNA序列正確，成功構(gòu)建了質(zhì)粒pGenesil-1GAT和pGenesil-1GTT。 2、將質(zhì)粒pGenesil-1GAT和

5、pGenesil-1GTT瞬時(shí)轉(zhuǎn)染到PANC-1細(xì)胞后，PANC-1特異性抑制組(轉(zhuǎn)染pGenesil-1GAT的細(xì)胞)細(xì)胞的K-ras基因mRNA和蛋白表達(dá)水平明顯下降，與交叉抑制組(轉(zhuǎn)染pGenesil-1GTT的細(xì)胞)相比結(jié)果有顯著性差異(p<0.05)，與轉(zhuǎn)染空白質(zhì)粒組(轉(zhuǎn)染pGenesil-1KB的細(xì)胞)相比結(jié)果有顯著性差異(p<0.05)，與對(duì)照組相比結(jié)果亦有顯著性差異(p<0.05)，細(xì)胞生長(zhǎng)明顯受限，對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后移，平臺(tái)

6、期水平低，細(xì)胞生長(zhǎng)曲線明顯向右下移動(dòng)，而PANC-1細(xì)胞交叉抑制組(轉(zhuǎn)染pGenesil-1GTT的細(xì)胞)的K-ras基因mRNA和蛋白表達(dá)水平下降不明顯，與轉(zhuǎn)染空白質(zhì)粒組(轉(zhuǎn)染pGenesil-1KB的細(xì)胞)相比結(jié)果無(wú)顯著性差異(p>0.05)，與未轉(zhuǎn)染的空白對(duì)照組最相比結(jié)果亦無(wú)顯著性差異(p>0.05)。細(xì)胞生長(zhǎng)未見(jiàn)明顯影響。 3、將質(zhì)粒pGenesil-1GAT和pGenesil-1GTT瞬時(shí)轉(zhuǎn)染到CFPAC-1細(xì)胞后，特

7、異性抑制組(轉(zhuǎn)染pGenesil-1GTT的細(xì)胞)K-ras基因mRNA和蛋白表達(dá)水平明顯下降，與交叉抑制組(轉(zhuǎn)染pGenesil-1GAT的細(xì)胞)相比結(jié)果有顯著性差異(p<0.05)，與空白質(zhì)粒組(轉(zhuǎn)染pGenesil-1KB的細(xì)胞)相比結(jié)果有顯著性差異(p<0.05)，與對(duì)照組相比結(jié)果亦有顯著性差異(p<0.05)，細(xì)胞生長(zhǎng)亦明顯受限。而交叉抑制組(轉(zhuǎn)染pGenesil-1GAT的細(xì)胞)K-ras基因mRNA和蛋白表達(dá)水平下降不明顯

8、，與空白質(zhì)粒組(轉(zhuǎn)染pGenesil-1KB的細(xì)胞)相比結(jié)果無(wú)顯著性差異(p>0.05)，與對(duì)照組相比結(jié)果亦無(wú)顯著性差異(p>0.05)，細(xì)胞生長(zhǎng)未受影響。 結(jié)論： 1、針對(duì)胰腺癌細(xì)胞K-ras基因突變位點(diǎn)設(shè)計(jì)的shRNA能夠有效地加載到pGencsil-1質(zhì)粒載體上，并且重構(gòu)的質(zhì)粒載體都可以高效的轉(zhuǎn)染人胰腺癌細(xì)胞株P(guān)ANC-1和CFPAC-1。 2、突變特異性的shRNA可以特異性的抑制相應(yīng)突變類型的K-ras