甘藍(lán)型油菜BnWRKY28轉(zhuǎn)錄因子功能分析.pdf

1、油菜是我國(guó)重要的經(jīng)濟(jì)作物之一，但是在實(shí)際生產(chǎn)過程中，往往會(huì)遭受到各種生物和非生物脅迫，嚴(yán)重影響油菜的產(chǎn)量。
　　在長(zhǎng)期的進(jìn)化過程中，植物形成了復(fù)雜的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)來(lái)抵御各種逆境脅迫，而轉(zhuǎn)錄因子在這個(gè)過程中起到了十分重要的作用。植物WRKY轉(zhuǎn)錄因子是重要的轉(zhuǎn)錄因子家族之一，WRKY蛋白得名于其N-端含有高度保守的氨基酸序列WRKYGQK及其特殊的鋅指結(jié)構(gòu)，它通過特異性識(shí)別并結(jié)合下游基因啟動(dòng)子區(qū)的(T)(T)TGAC(C/

2、T)序列(W-box)，從而發(fā)揮轉(zhuǎn)錄激活或抑制下游基因表達(dá)的調(diào)控作用。近年來(lái)有關(guān)植物WRKY轉(zhuǎn)錄因子的功能研究越來(lái)越多，其成員也廣泛參與了植物的多種轉(zhuǎn)錄調(diào)控進(jìn)程，如生長(zhǎng)發(fā)育、對(duì)生物或非生物的脅迫應(yīng)答反應(yīng)以及物質(zhì)代謝等。有些WRKY轉(zhuǎn)錄因子也表現(xiàn)出多效性，同時(shí)在植物生物進(jìn)程的多個(gè)方面起到調(diào)控作用，從而起到協(xié)調(diào)植物生長(zhǎng)發(fā)育和應(yīng)對(duì)外界環(huán)境之間平衡的作用。
　　本研究以甘藍(lán)型油菜寧RS-1和Westar為實(shí)驗(yàn)材料，從甘藍(lán)型油菜寧RS-1中

3、克隆得到來(lái)自Ⅱ-c亞族的Bn WRKY28基因cDNA序列，通過序列分析、誘導(dǎo)表達(dá)模式分析、亞細(xì)胞定位分析、過表達(dá)植株表型分析、激素處理、qRT-PCR、抗逆鑒定、內(nèi)源激素測(cè)定等方法初步探討了該BnWRKY28基因的相關(guān)生物功能，主要的研究結(jié)果如下:
　　1 BnWRKY28基因的克隆
　　利用同源克隆法克隆到甘藍(lán)型油菜中一個(gè)Bn WRKY28基因，該基因cDAN序列包括939bp的開放閱讀框，編碼一個(gè)含313個(gè)氨基酸的多肽

4、，預(yù)測(cè)分子量為34.973kDa，理論等電點(diǎn)為6.67。利用PlantCARE和PLACE軟件對(duì)該基因啟動(dòng)子區(qū)1kb序列進(jìn)行預(yù)測(cè)，得到一系列與生長(zhǎng)發(fā)育和脅迫應(yīng)答相關(guān)的順式作用元件，說明Bn WRKY28基因可能參與這些信號(hào)通路的調(diào)節(jié)。
　　2亞細(xì)胞定位與轉(zhuǎn)錄激活活性分析
　　將BnWRKY28基因融合GFP信號(hào)轉(zhuǎn)化擬南芥原生質(zhì)體進(jìn)行亞細(xì)胞定位，顯示BnWRKY28特異性的定位于細(xì)胞核中，具備轉(zhuǎn)錄因子的一般特性。在酵母中進(jìn)行轉(zhuǎn)

5、錄激活活性分析，顯示BnWRKY28具有轉(zhuǎn)錄激活的活性。
　　3誘導(dǎo)表達(dá)模式分析
　　利用qPCR分析BnWRKY28在甘藍(lán)型油菜Westar中的表達(dá)模式顯示，BnWRKY28受到信號(hào)分子水楊酸(SA)、茉莉酸甲酯(MeJA)以及腐生型真菌核盤菌（Sclerotinia sclerotiorum）誘導(dǎo)都上調(diào)表達(dá)，暗示BnWRKY28可能參與多種信號(hào)通路。
　　4油菜遺傳轉(zhuǎn)化及Bn WRKY28過表達(dá)株表型分析
　

6、　利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化方法轉(zhuǎn)化油菜下胚軸，通過組織培養(yǎng)得到BnWRKY28過表達(dá)轉(zhuǎn)基因油菜。與對(duì)照Westar相比，過表達(dá)植株在生長(zhǎng)發(fā)育上表現(xiàn)出種子發(fā)芽異常、幼苗下胚軸變短、側(cè)根發(fā)育減少而主根增長(zhǎng)、植株變矮小、葉型改變以及種子成熟異常等相關(guān)表型。
　　5 BnWRKY28參與GA路徑調(diào)控的分析
　　通過施加外源GA能夠部分恢復(fù)過表達(dá)株的下胚軸變短的表型，對(duì)GA合成代謝及信號(hào)傳導(dǎo)途徑的的相關(guān)基因表達(dá)分析顯示，在BnWRKY

7、28過表達(dá)株中，GA合成路徑關(guān)鍵合成酶基因GA20ox1顯著下調(diào)表達(dá)，而起鈍化作用的基因GA2ox1/GA2ox2上調(diào)表達(dá)，受GA負(fù)向調(diào)控的GA靶基因GID1a、GID1b、SLY1呈上調(diào)表達(dá)的趨勢(shì)，BnWRKY28參與了GA路徑的調(diào)控。
　　6 BnWRKY28參與生物與非生物脅迫的分析
　　對(duì)幼苗內(nèi)源激素JA和SA含量測(cè)定顯示，過表達(dá)株內(nèi)源JA含量顯著下降而SA含量無(wú)顯著變化，基因表達(dá)分析顯示過表達(dá)株中與SA途徑相關(guān)的基

8、因呈上調(diào)表達(dá)的趨勢(shì)，而與JA途徑相關(guān)的基因呈下調(diào)表達(dá)趨勢(shì)，過表達(dá)Bn WRKY28后植株對(duì)真菌性病害灰霉病菌的抗性似乎減弱了，說明BnWRKY28很可能參與正調(diào)控SA抗病信號(hào)途徑而負(fù)調(diào)控JA抗病信號(hào)途徑;此外，對(duì)幼苗用PEG-6000模擬干旱處理時(shí)，過表達(dá)株表現(xiàn)出對(duì)PEG-6000耐受性增強(qiáng)，說明BnWRKY28很可能也參與了植物滲透脅迫的調(diào)節(jié)。
　　綜上所述，BnWRKY28在植物的生長(zhǎng)發(fā)育中起到了重要調(diào)控作用，同時(shí)也參與了植物