甘藍(lán)、白菜和甘藍(lán)型油菜中串聯(lián)重復(fù)序列的特征及其所在基因的功能分析.pdf

1、油菜(rapeseed)屬十字花科(Cruciferae)蕓薹屬（Brassica L.），是世界上五大油料作物之一。甘藍(lán)、白菜和甘藍(lán)型油菜是蕓薹屬中非常重要的栽培類型。白菜型油菜（Brassica rapa）起源于我國(guó)，栽培歷史悠久，遺傳變異豐富，抗病性相對(duì)較弱。甘藍(lán)（Brassica oleracea）是變種較多的蔬菜和飼料植物，被認(rèn)為是英國(guó)及歐洲大陸海岸的野生甘藍(lán)經(jīng)長(zhǎng)期種植馴化而成的品系。甘藍(lán)型油菜（Braasicanapus）是

2、廣泛栽培的油菜類型，適應(yīng)性廣、抗病性好，在生產(chǎn)以及科研方面都占有極其重要的地位;但甘藍(lán)型油菜起源于歐洲，國(guó)內(nèi)栽培歷史較短，種質(zhì)資源相對(duì)匱乏。甘藍(lán)型油菜B.napus(AACC，2n=4x=38)是由其二倍體親本物種白菜B.rapa（AA，2n=2x=20）和甘藍(lán)B.oleracea(CC，2n=2x=18)經(jīng)天然雜交和染色體加倍而獲得的異源四倍體物種。甘藍(lán)型油菜基因組與二倍體親本（甘藍(lán)和白菜）基因組具有較高的同源性?，F(xiàn)代育種工作中，常通

3、過甘藍(lán)與白菜雜交的途徑獲得人工合成甘藍(lán)型油菜，這已成為豐富甘藍(lán)型油菜遺傳變異拓寬甘藍(lán)型油菜遺傳基礎(chǔ)的重要途徑。
　　人工合成甘藍(lán)型油菜的多倍化過程主要包括甘藍(lán)和白菜的種間雜交和染色體加倍兩大事件。種間雜交和染色體加倍過程必然伴隨著劇烈的基因組變異。這是因?yàn)榉N間雜交打破了物種間的界限，人為促進(jìn)不同物種原有的獨(dú)立的遺傳物質(zhì)的交流，擾亂了物種原有的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)秩序，導(dǎo)致基因組間遺傳物質(zhì)的重新調(diào)整與分配。研究表明，新合成多倍體的基因組發(fā)生了大

4、量的變異，這些變異也往往引起植物表型改變。
　　新合成多倍體基因組中，串聯(lián)重復(fù)序列（包括衛(wèi)星、小衛(wèi)星和微衛(wèi)星序列又稱簡(jiǎn)單重復(fù)序列Simple sequence repeats，SSRs）的快速大量產(chǎn)生或消失可對(duì)基因組大小及結(jié)構(gòu)產(chǎn)生重大影響，也是影響基因結(jié)構(gòu)、表達(dá)，導(dǎo)致基因功能改變的重要因素。在多倍化過程中，串聯(lián)重復(fù)序列是如何產(chǎn)生和發(fā)生變異的，這些變異體的序列特征及其相互關(guān)系如何，它們對(duì)多倍體物種基因組的進(jìn)化、物種表型和生物適應(yīng)性會(huì)

5、產(chǎn)生怎樣的影響等，值得進(jìn)一步研究。
　　本研究采用生物信息學(xué)分析與實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證相結(jié)合的方法。首先利用生物信息學(xué)方法對(duì)已有的甘藍(lán)、白菜和甘藍(lán)型油菜三個(gè)蕓薹屬物種序列(Plant Genomics Databaseassembled Unique Transcripts，PUTs)，進(jìn)行串聯(lián)重復(fù)序列的差異特征及對(duì)基因和基因組的影響分析。衛(wèi)星(satellite)和小衛(wèi)星（minisatellite）（即重復(fù)單元均大于10 bp的序列），我

6、們統(tǒng)稱為MiS-TR。結(jié)果如下:(1)來自于白菜的PUT-MiS-TR(PUT中檢測(cè)到的MiS-TR)的長(zhǎng)度、重復(fù)單元大小和這些重復(fù)序列中的GC含量，與甘藍(lán)中的PUT-MiS-TR基本一致，均高于甘藍(lán)型油菜中的PUT-MiS-TR;但甘藍(lán)型油菜中PUT-MiS-TR的頻率、相關(guān)轉(zhuǎn)座子的數(shù)目和插入/刪除(Indel)事件發(fā)生頻率均高于親本物種。(2)甘藍(lán)和白菜中包含MiS-TR的PUT序列多定位于某些細(xì)胞元件及膜上;甘藍(lán)型油菜中，定位在質(zhì)

7、膜和細(xì)胞器上的PUT序列高于白菜和甘藍(lán)。(3)白菜和甘藍(lán)中，參與蛋白結(jié)合的PUT-MiS-TR遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于甘藍(lán)型油菜;具有核苷酸結(jié)合功能的PUT-MiS-TR、具有酶活性的PUT-MiS-TR在甘藍(lán)型油菜中所占比例均高于白菜和甘藍(lán)。(4)與二倍體親本白菜和甘藍(lán)相比，異源四倍體甘藍(lán)型油菜含有較高的SSR密度、較豐富的復(fù)合型SSR模體、并且含有較多的單堿基模體的SSR和較大的平均重復(fù)數(shù)，還可檢測(cè)到較多的與脅迫反應(yīng)和發(fā)育過程有關(guān)的含有SSR的PU

8、T序列。因此推測(cè)，甘藍(lán)型油菜基因內(nèi)部MiS-TR數(shù)量和分布規(guī)律的改變、SSR的快速大量產(chǎn)生，對(duì)新合成多倍體物種的進(jìn)化以及多倍化過程中對(duì)環(huán)境變化的快速適應(yīng)具有重要影響。
　　另外，我們構(gòu)建了一個(gè)由自然甘藍(lán)型油菜和人工合成甘藍(lán)型油菜（甘藍(lán)×白菜）雜交后代衍生的DH（doubled-haploid DH）群體，簡(jiǎn)稱NR-DH，并以一個(gè)雙親均為自然甘藍(lán)型油菜的DH群體，簡(jiǎn)稱NN-DH，作為對(duì)照群體，研究了油菜基因組中的SSR變異:(1)N

9、R-DH群體中SSR的突變率（4.2×10-2每位點(diǎn)每世代）顯著高于對(duì)照NN-DH群體（3.2×10-3每位點(diǎn)每世代），且新型SSR變異體主要產(chǎn)生于NR-F1世代，其比例在NR-DH群體后代中得到保持;NR-DH群體所檢測(cè)到的編碼區(qū)內(nèi)的SSR變異體中，多數(shù)SSR的變異導(dǎo)致基因區(qū)域發(fā)生移碼突變(62.5％);發(fā)生刪除或者插入突變的SSR變異體導(dǎo)致氨基酸的丟失(12.5％)或者增加(25.0％)。(2)與親本相比，NR-F1世代即有序列消失

10、現(xiàn)象出現(xiàn)，NR-DH群體中SSR消失序列的比例比NR-F1世代增加了三倍。(3)染色體定位分析表明，新型和消失的片段，在甘藍(lán)和白菜染色體上不均衡分布。可以推測(cè)在基因組純化過程中，來自白菜的A染色體組和甘藍(lán)的C染色體組與自然甘藍(lán)型油菜中的AC染色體組間的錯(cuò)配是導(dǎo)致序列丟失進(jìn)而導(dǎo)致甘藍(lán)型油菜基因組縮小的重要原因。
　　綜上所述，多倍化過程引起的串聯(lián)重復(fù)序列的大量發(fā)生、變異或消失，是多倍化過程在核酸水平上留下的重要印跡，反映了多倍體基因