人IgMμ鏈恒定區(qū)各肽段的基因合成原核表達及免疫原性分析.pdf

1、免疫球蛋白M(IgM)是人的免疫球蛋白之一,根據結構的不同將免疫球蛋白分為五種,其他還有l(wèi)gA、lgG、IgD和lgE。IgM占血清免疫球蛋白總量的5％-10%,是分子量最大的Ig,一般不能通過血管壁,主要存在于血液中。IgM也是初次體液免疫應答中最早出現(xiàn)的抗體,是機體抗感染的“先頭部隊”,血清中檢出IgM提示新近發(fā)生感染,可用于感染的早期診斷。在感染過程中IgM首先出現(xiàn),但持續(xù)時間不長,是近期感染的標志。
　　IgM分子包括重鏈

2、μ鏈和輕鏈λ,輕鏈是各類免疫球蛋白共有,重鏈μ鏈是IgM分子所特有的,已有研究表明抗人IgMμ鏈單克隆抗體可用于多種感染性疾病的早期診斷以及免疫學的研究。但是用于制備抗人IgMμ鏈單克隆抗體的天然的IgMμ鏈來源少,制備方法繁瑣,價格較高,而且IgMμ鏈本身易降解。因此,本研究利用基因工程技術,通過重組構建、原核表達IgMμ鏈恒定區(qū)各肽段,并對其免疫原性進行檢測,以期得到免疫原性同天然IgMμ鏈相近的肽段,能夠進一步用于制備抗人IgMμ

3、鏈單克隆抗體。
　　本研究分為一下兩個部分:
　　第一部分，基因合成以及原核表達IgMμ鏈恒定區(qū)各肽段
　　分析IgM的結構,IgM的重鏈有一個可變區(qū)(VH)和四個恒定區(qū)(CHl、CH2、CH3和CH4)共五個功能區(qū)。VL和VH是與抗原結合的部位,單體由一對L鏈和一對H鏈組成的基本結構,有2個與抗原結合的位點,共分為可變區(qū)和恒定區(qū),H和L鏈上都有可變區(qū),同類重鏈和同型輕鏈的近N端約110個氨基酸序列的變化很大,其他部分

4、的氨基酸序列相對恒定,據此可將輕鏈和重鏈區(qū)分為可變區(qū)(V)和恒定區(qū)(C)。IgM分子包括重鏈μ鏈和輕鏈λ,輕鏈是各類免疫球蛋白共有,重鏈μ鏈是IgM分子所特有。
　　通過GenBank數(shù)據庫查詢的到人IgMμ鏈恒定區(qū)完整的氨基酸序列,根據GenBank數(shù)據庫IgMμ鏈恒定區(qū)(CH1-CH4)的cDNA序列并進行必要的大腸桿菌密碼子優(yōu)化,本研究構建了并原核表達了IgMμ鏈恒定區(qū)3個肽段。具體方法如下:分別獲得IgMμ鏈(CH1-CH

5、4)、IgMμ鏈(CH1-CH2)、IgMμ鏈(CH3-CH4)基因片段,利用重疊延伸PCR(OverlapExtensionPloymeraseChainReaction,OE-PCR)體外基因合成人IgMμ鏈恒定區(qū)全長(CH1-CH4)及其截斷片段CH1-CH2和CH3-CH4。用T/A克隆法將各片段克隆至pMD18-T載體進行測序。將測序正確的序列分別克隆到原核表達載體pPET-32a,構建其原核表達質粒:PET32a-rMμCH

6、1-CH4,PET32a-rMμCH1-CH2和PET32a-rMμCH3-CH4,將上述原核表達質粒分別轉入E.coliBL21(DE3)中,經IPTG誘導表達,獲得3種截短的IgMμ鏈恒定區(qū)融合蛋白ET32a-rMμCH1-CH4,PET32a-rMμCH1-CH2和PET32a-rMμCH3-CH4,其相對分子量分別約為:69.8KD、43.8KD、46.9KD并用Ni-NTA親和層析法純化目的融合蛋白。通過12%SDS-PAGE

7、電泳分析,分別可見分子量約為69.8KD、43.8KD、46.9KD左右的特異的條帶,大小與理論值相符。表明本研究成功構建并表達出PET32a-rMμCH1-CH4,PET32a-rMμCH1-CH2和PET32a-rMμCH3-CH4融合蛋白。
　　第二部分，重組蛋白免疫原性分析及與天然人IgM、IgMμ鏈和IgG比較
　　用PET32a-rMμCH1-CH4,PET32a-rMμCH1-CH2和PET32a-rMμCH3

8、-CH4融合蛋白分別免疫BALB/c小鼠,制備小鼠抗血清,用以觀察誘導產生針對IgMμ鏈的特異性抗體情況;用天然的人IgM、IgMμ鏈和IgG免疫BALB/c小鼠,制備小鼠抗血清,以檢測融合蛋白PET32a-rMμCH1-CH4,PET32a-rMμCH1-CH2和PET32a-rMμCH3-CH4誘導產生產生針對IgMμ鏈的特異性抗體于天然IgM、IgMμ鏈之間的差異,以及天然的人IgM、IgMμ鏈和IgG之間交叉反應性。
　　

9、ELISA檢測結果顯示,上述PET32a-rMμCH1-CH4,PET32a-rMμCH1-CH2和PET32a-rMμCH3-CH4融合蛋白均可以與天然的IgM、IgMμ鏈特異性反應,表明重組蛋白具有與天然IgMμ鏈的反應能力,保留了IgMμ鏈的免疫原性。然而,重組蛋白的免疫原性較天然的IgMμ鏈稍弱,誘導產生的抗體滴度稍偏低,(取對數(shù)后抗體滴度為3.2-2),而天然的IgMμ鏈誘導產生較高的抗體滴度(取對數(shù)后抗體滴度為4.5),提示

10、截斷表達IgMμ鏈可能對其免疫原性產生影響。其次天然的人IgM、IgMμ鏈和IgG免疫產生的抗血清,IgM免疫的血清與IgG有較強的交叉反應性,同樣IgG免疫的血清與IgM也存在較強的交叉反應性;與IgM不一樣的IgMμ免疫的血清與IgG交叉反應弱。
　　總結:
　　1.本研究成功構建3種IgMμ鏈重組肽段的原核表達質粒并經E.coli表達,獲得了3種截短的IgMμ鏈3個肽段的重組蛋白。
　　2.所構建的3種蛋白PET

11、32a-rMμCH1-CH4,PET32a-rMμCH1-CH2和PET32a-rMμCH3-CH4均較好的保留了IgMμ鏈的免疫原性,誘導出較高滴度的針對IgMμ鏈的特異性抗體,提示重組的3各肽可能可以代替天然的IgMμ鏈,成為制備抗IgMμ鏈單克隆抗體的原料。為利用基因工程探尋天然IgMμ鏈的代替品奠定了基礎。
　　3.用天然的人IgM、IgMμ鏈和IgG免疫BALB/c小鼠,制備小鼠抗血清,IgM免疫的血清與IgG有較強的交

12、叉反應性,IgG免疫的血清與IgM也存在較強的交叉反應性;與IgM不一樣的IgMμ鏈免疫的血清與IgG交叉反應弱。而重組的PET32a-rMμCH1-CH4,PET32a-rMμCH1-CH2和PET32a-rMμCH3-CH4融合蛋白與IgG無明顯的交叉反應,提示抗IgMμ鏈的單克隆抗體比抗IgM的單克隆抗體更具特異性,在臨床感染性疾病的早期診斷和免疫學的研究就中更加的精確,重組的PET32a-rMμCH1-CH4,PET32a-rM