風(fēng)濕康的藥理藥效學(xué)研究.pdf

1、一、目的與意義： 類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(Rheumatoidarthritis，RA)是一種以關(guān)節(jié)滑膜炎癥為主要臨床表現(xiàn)的慢性、進(jìn)行性、系統(tǒng)性疾病。根據(jù)流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果顯示，全世界成人發(fā)病率為0.5～1％；在我國(guó)成人RA患病率約為0.3％。RA有較高的致殘率，患者往往承受巨大的心理壓力，生活質(zhì)量較常人明顯降低。 RA屬于多因子致病，其具體發(fā)病原因至今尚未完全闡明。從總體上講，該病是在遺傳易感性的基礎(chǔ)上，由外界因素促發(fā)的一種疾病。

2、此外，身高、體重、性別、情緒、氣候、環(huán)境等和RA的發(fā)病也有密切的關(guān)系。 T細(xì)胞譜系是認(rèn)識(shí)RA病理機(jī)制的里程碑。目前較為流行的觀點(diǎn)是RA為抗原呈遞細(xì)胞和CD4+T細(xì)胞相互作用的結(jié)果。此外T細(xì)胞介導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎癥反應(yīng)也與滑膜中TCRγδT細(xì)胞有關(guān)。Th1/Th2動(dòng)態(tài)平衡的失調(diào)也是RA病理機(jī)制之一，其中恒定性自然殺傷性T細(xì)胞即可以產(chǎn)生保護(hù)性Th2細(xì)胞因子。 細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)是RA病理破壞過(guò)程的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。其中腫瘤壞死因子-α(Tumor

3、necrosisfactor-α，TNF-α)和白介素1(Interleukin-1，IL-1)在RA疾病的研究中備受關(guān)注。它們可能對(duì)滑膜炎癥的發(fā)生、發(fā)展及滑膜血管翳的形成具有十分重要的作用。除此之外，尚有部分白介素家族、趨化因子家族、生長(zhǎng)因子家族等直接參與組織損傷。 病理機(jī)制的不確定性導(dǎo)致治療上的多靶點(diǎn)和盲目性。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)在RA的臨床治療，現(xiàn)今仍然是以非甾體抗炎藥(NSAIDs)、改變病情藥(DMARDs)和皮質(zhì)激素為主，這些藥

4、物在很大程度上可以改善病情，緩解癥狀，但是長(zhǎng)期服用存在著許多的不良反應(yīng)，如NSAIDs的胃腸道反應(yīng)和腎毒性，DMARDs中甲氨喋呤、環(huán)磷酰胺的胃腸道反應(yīng)和肝毒性，來(lái)氟米特(Leflunomide，LEF)可引起月經(jīng)不調(diào)、繼發(fā)性肺部及皮膚炎癥等，皮質(zhì)激素增加感染的易感性、引起消化道潰瘍和骨質(zhì)疏松等。而近幾年出現(xiàn)的針對(duì)某些關(guān)鍵細(xì)胞因子的生物制劑如重組人Ⅱ型TNF-α受體-抗體融合蛋白，重組人IL-1受體拮抗劑、抗TNF-α單克隆嵌合抗體等已

5、經(jīng)應(yīng)用于臨床，取得一定的療效，但因其價(jià)格昂貴，并容易形成新的免疫紊亂，存在一定的風(fēng)險(xiǎn)，因此尚無(wú)法大范圍地推廣。 中醫(yī)雖然無(wú)RA這一病名的記載，但是根據(jù)RA的發(fā)病特點(diǎn)和臨床表現(xiàn)，多將其歸屬于“痹病”范疇，因其特異的證候特點(diǎn)，又有“頑痹”、“歷節(jié)風(fēng)”之稱。中醫(yī)對(duì)痹病的認(rèn)識(shí)已有兩千多年的歷史，對(duì)它的病因、病機(jī)、辨證論治等方面進(jìn)行了長(zhǎng)期而廣泛深入的探討，形成了較完整的理論系統(tǒng)，在臨床上有著自己獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。近年來(lái)各醫(yī)家對(duì)“風(fēng)寒濕"理論也作

6、了較多的補(bǔ)充，如“腎虛”論、“虛、邪、瘀”論等。因而在RA的臨床治療上，中醫(yī)藥一直發(fā)揮著重要作用。因此，如何利用傳統(tǒng)中醫(yī)藥的特長(zhǎng)，加大傳統(tǒng)有效方和經(jīng)驗(yàn)方的開(kāi)發(fā)研究，更好地為風(fēng)濕病臨床服務(wù)，是當(dāng)今中醫(yī)藥界奮斗的目標(biāo)。 風(fēng)濕康(FengShiKang，F(xiàn)SK)是吳啟富教授治療風(fēng)濕病臨床應(yīng)用二十多年的經(jīng)驗(yàn)方，具有清熱除濕、活血通絡(luò)、理氣止痛功效，其藥物組成有：黃柏、牛膝、蒼術(shù)、知母、細(xì)辛、秦艽、桂枝、徐長(zhǎng)卿等。本研究擬用動(dòng)物疼痛和炎癥

7、模型來(lái)研究FSK對(duì)急、慢性炎癥的抗炎鎮(zhèn)痛效果，用佐劑性關(guān)節(jié)炎(AdjuvantArthritis，AA)動(dòng)物模型觀察FSK對(duì)從鼠病理改變的影響，并初步探討其基本作用機(jī)制。 二、方法與內(nèi)容： 2.1FSK抗炎鎮(zhèn)痛作用的研究 2.1.1小鼠扭體實(shí)驗(yàn) 取雌性小鼠50只，隨機(jī)分為5組，即空白對(duì)照組、布洛芬組、FSK低、中、高劑量組，連續(xù)灌胃給藥3d，于末次給藥后30min，每只小鼠腹腔注射0.6％冰醋酸0.2ml

8、，觀察小鼠在20min內(nèi)出現(xiàn)的扭體次數(shù)。 2.1.2小鼠熱板實(shí)驗(yàn) 取體重18～22g的雌性小白鼠，置于(55±0.5)℃熱板上，觀察小鼠舔后足的所需時(shí)間(s)，作為痛閾指標(biāo)。選擇痛閾在10～30s的小鼠50只，隨機(jī)分為5組，即空白對(duì)照組、布洛芬組、FSK低、中、高劑量組，連續(xù)灌胃給藥3d。分別記錄給藥前、給藥后30min、60min、90min的痛域值。 2.1.3二甲苯致小鼠耳腫脹實(shí)驗(yàn) 取雄性小鼠50只

9、，隨機(jī)分為5組，即空白對(duì)照組、強(qiáng)的松組、FSK低、中、高劑量組，連續(xù)灌胃給藥3d，于末次給藥后30min，每鼠右側(cè)耳廓正反面均勻涂抹二甲苯15μl，15min后脫臼處死，沿耳廓對(duì)稱剪下小鼠兩耳，用打孔器在左右耳廓相同部位打孔取材，精密電子天平稱量，計(jì)算腫脹度(mg)。 2.1.4腹腔毛細(xì)血管通透性增高實(shí)驗(yàn) 取雌性小鼠50只，隨機(jī)分為5組，即空白對(duì)照組、強(qiáng)的松組、FSK低、中、高劑量組，連續(xù)灌胃給藥3d，于末次給藥后30m

10、in，各小鼠尾靜脈注射0.5％依文思蘭溶液，隨即腹腔注射0.6％的冰醋酸溶液，20min后脫頸椎處死，腹腔注射5ml生理鹽水，輕揉小鼠腹部，使腹腔內(nèi)染料充分溶于生理鹽水中并混合均勻，剪開(kāi)腹部肌肉，吸管吸出洗滌液，離心，取上清液在紫外分光光度計(jì)上595nm比色測(cè)定吸光度。 2.2FSK對(duì)大鼠從的影響 選取從模型鼠50只，隨機(jī)分為5組，即空白對(duì)照組、模型組、LEF組、FSK低劑量組、FSK高劑量組，從致炎當(dāng)天開(kāi)始灌胃給藥，連

11、續(xù)給藥30天。給藥過(guò)程中紀(jì)錄模型鼠的體重、足容積及炎癥積分的變化。第30天處死大鼠，膝、踝關(guān)節(jié)取材，常規(guī)切片HE染色，并進(jìn)行組織學(xué)觀察和評(píng)分。 2.3FSK藥理機(jī)制的初步探討 2.3.1FSK對(duì)AAT淋巴細(xì)胞亞群的影響 取抗凝血100μl，依次加入FITC-CD3、APC-CD4、PE-CD8a抗體孵育，再加入紅細(xì)胞裂解液，以PBS洗滌，懸浮細(xì)胞上機(jī)檢測(cè)。 2.3.2FSK對(duì)從TNF-α、IL-1的影響

12、 用ELISA法測(cè)定大鼠血清中TNF-α和大鼠關(guān)節(jié)組織勻漿中IL-1的含量，比較五組之間的藥物干預(yù)對(duì)大鼠炎癥細(xì)胞因子的影響。 三、結(jié)果與分析： 3.1FSK抗炎鎮(zhèn)痛作用的研究 與空白對(duì)照組相比，布洛芬組、FSK低、中、高劑量組的小鼠在20min內(nèi)扭體次數(shù)均有顯著性差異(F=30.118，P=0.000)，提示各個(gè)藥物組均能減少小鼠扭體反應(yīng)的次數(shù)，對(duì)小鼠疼痛有抑制作用。在熱板實(shí)驗(yàn)中，在不同時(shí)間內(nèi)的痛域值有顯著

13、性差異(F=19.401，P=0.000)，各個(gè)藥物組之間的痛域值差異有顯著性意義(F=5.250，P=0.001)。與空白對(duì)照組相比較，布洛芬組、FSK低、中、高劑量組的痛域值呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，在第90min時(shí)，痛域值差異具有顯著性(P=0.013)。在耳腫脹實(shí)驗(yàn)中，強(qiáng)的松組及FSK低、中、高劑量組的腫脹度均低于空白對(duì)照組。結(jié)果提示各個(gè)藥物組均能抑制二甲苯致小鼠耳廓腫脹度，對(duì)急性炎癥具有抑制作用。在腹腔毛細(xì)血管通透性增高實(shí)驗(yàn)中，強(qiáng)的松組、

14、FSK低、中、高劑量組的伊文思蘭的含量均低于空白對(duì)照組，提示強(qiáng)的松和FSK均能抑制冰醋酸所致的小鼠毛細(xì)血管通透性增高，使腹腔滲出的染料減少，對(duì)急性滲出性炎癥顯示出抗炎作用。 3.2FSK對(duì)大鼠AA病理改變的影響 致炎后，足腫脹度與炎癥積分在不同時(shí)間點(diǎn)以及不同觀察組之間的變化均具有顯著性差異，并且兩者的改變趨勢(shì)基本一致。模型組的平均腫脹度和炎癥積分均高于其他觀察組。而LEF組和FSK低、高劑量組的足腫脹度和炎癥積分從第13

15、天和第16天開(kāi)始后就表現(xiàn)出下降的趨勢(shì)，這說(shuō)明FSK對(duì)AA的急性期炎癥有較好的抑制作用，但較LEF組起效時(shí)間緩慢。從病理觀察結(jié)果來(lái)看，LEF組和FSK低、高劑量組病理積分顯著低于模型組(F=5.121，P=0.005)，說(shuō)明LEF、FSK對(duì)從急性期炎癥有一定的抑制作用。 3.3FSK藥理機(jī)制的初步探討 空白對(duì)照組、模型組、LEF組、FSK低、高劑量組之間的CD4+含量有顯著性差異(F=5.840，P=0.002)，CD8+

16、含量無(wú)顯著性差異(F=2.733，P=0.052)，以及CD4+/CD8+的比值差異顯著(F=12.233，P=0.014)。LEF組、FSK低、高劑量組的CD4+水平與模型組相比較降低，CD8+水平增加，CD4+/CD8+的比值下降。同時(shí)發(fā)現(xiàn)，空白對(duì)照組、模型組、LEF組、FSK低、高劑量組的TNF-α和IL-1濃度均有顯著性差異(F=2.698，P=0.044；F=11.327，P=0.000)。和空白組相比，模型組的TNF-α和I

17、L-1濃度均上升；和模型組相比，LEF組、FSK低、高劑量組的TNF-α和IL-1濃度均降低。 四、結(jié)論： 4.1FSK對(duì)急性炎癥有較好的抗炎、鎮(zhèn)痛作用，能夠延長(zhǎng)物理刺激和化學(xué)物質(zhì)所引起的急性疼痛的痛域，在以血管通透性為主要改變的急性炎癥模型實(shí)驗(yàn)中，對(duì)二甲苯導(dǎo)致的鼠耳腫脹和對(duì)冰醋酸引起的腹腔血管通透性的升高有抑制作用，這些實(shí)驗(yàn)均能表明FSK具有抗炎鎮(zhèn)痛作用。 4.2AA動(dòng)物試驗(yàn)表明，F(xiàn)SK能夠控制急性期炎癥，減輕