綠盲蝽溫度受體基因的鑒定及功能研究.pdf

1、昆蟲的生長發(fā)育、遷飛、滯育、休眠等生命活動和重要的行為與溫度變化息息相關(guān)。在長期的進化過程中，快速感知外界環(huán)境溫度變化并迅速做出相應(yīng)的行為反應(yīng)對于昆蟲的正常生存和繁衍極其重要。以前的研究表明瞬時受體電位通道（transient receptor potential，TRP）參與了昆蟲對溫度的感知行為，被認為是哺乳動物和昆蟲體內(nèi)溫度的受體。綠盲蝽Apolygus lucorum(Meyer-Dür)屬于半翅目(Hemiptera)，盲蝽科

2、(Miridae)，草盲蝽屬（lygus Hahn），是我國多種農(nóng)作物和果樹上的重要害蟲。本論文通過生物信息學(xué)方法分析綠盲蝽轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，獲得了綠盲蝽兩個溫度受體基因（TRPA1和Painless）的片段，通過PCR結(jié)合RACE技術(shù)克隆了編碼TRPA1和Painless的全長cDNA序列;分析了TRPA1及Painless基因在綠盲蝽不同發(fā)育階段及成蟲不同組織中的相對表達量;通過真核表達結(jié)合雙電極電壓鉗記錄揭示了綠盲蝽TRPA1及Pain

3、less基因的功能，通過行為學(xué)實驗研究了綠盲蝽對溫度及化合物刺激的行為反應(yīng)。主要研究結(jié)果如下:
　　1.完成了綠盲蝽TRPA1基因的鑒定及功能研究。在觸角轉(zhuǎn)錄組測序基礎(chǔ)上，利用生物信息學(xué)方法獲得了綠盲蝽TRPA1基因的4個序列片段，通過序列比對，結(jié)合分子克隆技術(shù)得到綠盲蝽TRPA1基因的四個剪切型的全長序列，分別命名為AlucTRPA1-A、AlucTRPA1-B、AlucTRPA1-C、AlucTRPA1-D。四個剪切型均包含6

4、個保守的跨膜結(jié)構(gòu)域及16個錨蛋白重復(fù)序列，該基因在1至5齡若蟲及成蟲中均有表達，且1齡若蟲的相對表達量最高;在成蟲的不同組織中，觸角中的表達量最高。四種剪切型僅在腹部及翅的相對表達量存在顯著差異。體外功能研究表明，除了AlucTRPA1-D，其他三種剪切型均可被20-40℃逐漸上升的溫度激活，而且重復(fù)刺激不會引起通道的鈍化。AlucTRPA1-A及AlucTRPA1-B的激活溫度小于25℃，而AlucTRPA1-C的激活溫度在25-30

5、℃之間。除了對溫度的反應(yīng)外，四種剪切型中，僅AlucTRPA1-A和AlucTRPA1-C對刺激性化合物異硫氰酸烯丙酯(AITC)、肉桂醛(CA)及香茅醛（citronellal）有明顯反應(yīng)。
　　2.完成了綠盲蝽Painless基因的鑒定及功能研究。利用生物信息學(xué)方法得到綠盲蝽Painless基因的4個cDNA片段，通過RT-PCR結(jié)合RACE技術(shù)克隆得到綠盲蝽Painless基因的全長序列，命名為AlucPainless。該基

6、因全長2736 bp，編碼911個氨基酸，蛋白結(jié)構(gòu)包含6個保守的跨膜結(jié)構(gòu)域及8個錨蛋白重復(fù)序列。時空表達譜分析結(jié)果表明，AlucPainless基因在整個生命周期均有表達，1齡若蟲的相對表達量最高;在成蟲的不同組織中，足中的表達量最高，頭中最低?；谧嘎涯讣毎捏w外功能研究表明，10-3 mol/L的刺激性化合物不能激活A(yù)lucPainless通道。20-45℃逐漸上升的溫度可以激活A(yù)lucPainless通道。由于AlucPainl

7、ess通道在20-25℃、20-30℃、20-35℃及20-40℃溫度區(qū)間的反應(yīng)值與對照組沒有顯著差異，因此AlucPainless基因的激活溫度大于40℃。
　　3.完成了綠盲蝽對溫度、氣味刺激的行為反應(yīng)實驗。綠盲蝽在溫度梯度平板上的分布主要集中于25-28℃，綠盲蝽在高溫區(qū)沒有分布，表明綠盲蝽能夠感知環(huán)境溫度。雙向選擇實驗表明1％ CA、10％ CA、1％ citronellal及10％ citronellal趨避綠盲蝽，而綠