三種遺傳性疾病的基因診斷及分子發(fā)病機制研究.pdf

1、本研究對導(dǎo)致Ⅱ型遺傳性抗凝血酶(antithrombin，AT)缺陷癥的突變熱點ATLeu99進(jìn)行了突變蛋白的結(jié)構(gòu)與功能研究，以探討AT Leu99突變導(dǎo)致遺傳性AT缺陷癥的分子機制。此外，本研究收集了石骨癥(Osteopetrosis)和X連鎖先天性腎上腺發(fā)育不良(X linked adrenal hypoplasia congenita，XL-AHC)等罕見性遺傳病家系，并對此開展了臨床表現(xiàn)、家系調(diào)查、實驗室檢測和基因診斷（TCIR

2、G1基因、CLCN7基因和NROB1基因）等方面的研究;對所發(fā)現(xiàn)的CLCN7基因剪接位點突變c.1798-1G＞T進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄研究，以探討其導(dǎo)致石骨癥的分子發(fā)病機制。
　　AT是人體抗凝系統(tǒng)的主要因子之一，遺傳性AT缺陷癥是由編碼AT蛋白的基因突變所引起，是靜脈血栓栓塞癥的主要遺傳性危險因素。AT Leu99是導(dǎo)致Ⅱ型AT缺陷癥的突變熱點，已在多個家系中有報道，本研究構(gòu)建了多種Leu99突變表達(dá)質(zhì)粒（Leu99Phe、Leu99Va

3、l、Leu99Ala、Leu99Ile以及Leu99Ser），在體外探討Leu99突變導(dǎo)致遺傳性AT缺陷癥的分子機制。實時熒光RT-PCR顯示Leu99突變AT基因和野生型AT(AT WT)基因在轉(zhuǎn)錄水平無差異;同位素代謝示蹤實驗顯示，Leu99Phe和Leu99Val突變AT表達(dá)受損，分別為AT WT的36.9％和13.8％。采用果蠅S2細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)對AT WT和Leu99突變AT進(jìn)行表達(dá)和純化。肝素結(jié)合試驗顯示AT Leu99Val

4、、Leu99Ala、Leu99Ile和Leu99Ser突變AT蛋白與低分子量肝素鈉的結(jié)合分別為相同濃度AT WT的(44.8±3.6)％、(118.9±14.0)％、(15.2±8.8)％和(23.0±8.2)％。表面等離子共振實驗顯示AT Leu99Val、Leu99Ala、Leu99Ile和Leu99Ser突變蛋白與凝血酶的結(jié)合分別為相同濃度AT WT的13％、57％、3％和29％; AT Leu99Val、Leu99Ala、Leu

5、99Ile和Leu99Ser突變AT蛋白與FXa的結(jié)合分別為相同濃度AT WT的7％、51％、1％和25％。發(fā)色底物法顯示，AT WT及Leu99Val、Leu99Ala、Leu99Ile、Leu99Ser等突變型AT蛋白活性分別為146.5％、21.4％、120.9％、10.8％和39.0％。圓二色性檢測顯示Leu99突變導(dǎo)致AT蛋白二級結(jié)構(gòu)中α-螺旋減少、β-片層增多，可見Leu99位點不同氨基酸側(cè)鏈可引起AT空間構(gòu)象的改變，從而使

6、AT與肝素或凝血酶、FXa等底物的結(jié)合受到不同程度的破壞。AT抗原水平的下降以及AT與肝素和底物的結(jié)合受損，均導(dǎo)致了AT蛋白抗凝活性的下降，從而導(dǎo)致遺傳性AT缺陷癥。
　　石骨癥是一種罕見的遺傳性骨發(fā)育障礙性疾病，以破骨細(xì)胞異常、骨吸收缺陷及骨硬化為特征，臨床表型及基因型十分多樣。本研究通過TCIRG1基因和CLCN7基因的檢測，在石骨癥家系先證者中發(fā)現(xiàn)了TCIRG1基因復(fù)合雜合突變:c.909C＞A(p.Tyr303X)和c.2

7、008C＞T(p.Arg670X)以及CLCN7基因雜合剪接位點突變:c.1798-1G＞T。通過對先證者外周血白細(xì)胞中的CLCN7因轉(zhuǎn)錄本的分析，發(fā)現(xiàn)CLCN7基因c.1798-1G＞T突變導(dǎo)致了2種發(fā)生比例不同的異常CLCN7剪接，其中發(fā)生比例較高的是CLCN7因20號外顯子缺失，而發(fā)生比例較低的是潛在剪接位點的激活，即CLCN7因20號外顯子起始處24 bp缺失。TCIRG1基因和CLCN7基因同時突變的石骨癥病例目前未見報道;此

8、外，TCIRG1基因c.909C＞A p.Tyr303X突變和CLCN7基因c.1798-1G＞T突變目前亦未見報道。通過本研究，該家系先證者確診為常染色體隱性遺傳石骨癥。
　　XL-AHC是一種罕見的遺傳性腎上腺皮質(zhì)發(fā)育缺陷性疾病，臨床表現(xiàn)輕重不一，NROB1基因突變是導(dǎo)致XL-AHC的致病原因。本研究中XL-AHC家系先證者主要表現(xiàn)為腎上腺皮質(zhì)功能低下伴/不伴低促性腺激素性腺發(fā)育不良，在不同的先證者中共檢測到7種不同的NROB

9、1基因突變，即c.871T＞G(p.Trp291Gly)、c.376G＞A(p.Val126Met)、 c.195_207delinsTG(p.Cys66GlyfsX2)、 c.833T＞C(p.Leu278Pro)、c.543delA(p.Gly183ValfsX80)、c.1102delT(p.Cys368AlafsX3)以及c.501delA(p.Gly169AlafsX94)，其中c.871T＞G、c.195_207delins