y遺傳性疾病基因治療的進(jìn)展

1、遺傳性疾病基因治療進(jìn)展,安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院 小兒神經(jīng)康復(fù)中心The 1st affiliated hospital of AHMU Neurological rehabilitation center of pediatrics department,唐久來(lái) 教授,定義,遺傳性疾?。╤ereditary / inherited / genetic disease）簡(jiǎn)稱遺傳病，是指生殖細(xì)胞或受精卵的遺傳物質(zhì)（染色體和基因

2、）發(fā)生突變（或畸變）所引起的疾病。,遺傳性疾病的分類,遺傳病目前有6000多種，一般分為：基因?。╣enic disease） 單基因病 （monogenic disease） 單基因病可按遺傳方式而再分類 。 多基因?。╬olygenic disease）。染色體病（chromosomal disease）。 常染色體異常、性染色體異常。,遺傳性疾病的發(fā)病率,基因病單基因病 2.5 ％ 常染色體顯性遺傳

3、病 0.9 ％ 常染色體隱性遺傳病 1.3 ％ 性連鎖遺傳病 (脆性X綜合癥） 0.3 ％多基因病 18.0 ％ 染色體病 0.54 ％常染色體異常 0.36 ％性染色體異常 0.182 ％,遺傳性疾病的病因病理,疾病基因基因突變?nèi)旧w畸變 父母遺傳、環(huán)境因素（孕母年齡、宮內(nèi)病毒 感染、放射線及化學(xué)因素）,遺傳性疾病的診斷,主要根據(jù)典型的臨床表現(xiàn)及實(shí)驗(yàn)室診斷，實(shí)驗(yàn)室

4、診斷主要染色體檢查和基因診斷?；蛟\斷對(duì)疾病的機(jī)理、治療和新藥的研發(fā)都具有劃時(shí)代的意義。,基因診斷的意義(治療和研發(fā)新藥),最近，英國(guó)科學(xué)家發(fā)現(xiàn)引起肥胖的相關(guān)基因，該基因使人體更易過(guò)多吸收脂肪而導(dǎo)致肥胖癥、糖尿病、高血壓和心臟病。進(jìn)而研發(fā)新的治療藥物。他們發(fā)現(xiàn)3種罕見(jiàn)疾病病因都與人體過(guò)多吸收脂肪有關(guān)。第一種病叫乳糜微粒血癥，第二種病是糖源儲(chǔ)積病四型，又名安德森病，第三種病是另一類乳糜微粒血癥。,這3種疾病都與人體代謝功能失調(diào)有關(guān)

5、。一種叫Sar1b的蛋白在吸收食物脂肪時(shí)出現(xiàn)功能失調(diào)。他們對(duì)來(lái)自全球的一些病例進(jìn)行了比較研究，發(fā)現(xiàn)3種疾病所有患者都有相同遺傳基因變異。帝國(guó)理工學(xué)院的專家說(shuō)，今后的研究將集中在Sar1b蛋白的遺傳基因類型方面。這項(xiàng)研究可能對(duì)了解肥胖癥的病因和治療提供重要線索。,遺傳病的治療,遺傳病的治療是對(duì)遺傳病患者采取一定的方法以糾正或改善機(jī)體病理性狀態(tài)的醫(yī)學(xué)措施，從基因缺陷到出現(xiàn)臨床表現(xiàn)，涉及到很多病理變化過(guò)程，每一病理過(guò)程都可能成為遺傳病治療的著

6、眼點(diǎn)。,染色體病的治療,染色體病不僅沒(méi)有辦法根治，改善癥狀也很困難，個(gè)別性染色體異常，如Klinefelter綜合征早期使用睪酮， X染色體畸變引起疾病的女性患者，可以補(bǔ)充雌激素，使患者的第二性征得到發(fā)育也可改善患者的體格發(fā)育；真兩性畸形進(jìn)行外科手術(shù)等有助于癥狀改善。,基因病的治療,由于多基因病的發(fā)病中環(huán)境因素起著重要的作用，故對(duì)藥物治療有較肯定的療效；而單基因病的藥物極少有效，且療效不肯定，如分子病和酶病的治療目前只能針對(duì)不同的發(fā)病環(huán)

7、節(jié)，采取措施，可收到一定的效果，有些還只能達(dá)到在一定時(shí)期內(nèi)改善癥狀的目的，根本的方法只有等待基因治療。,遺傳基因病治療的治療有與一般疾病相同或相似的方法，也有它治療本身所特有的方法。近年來(lái)，隨著重組DNA技術(shù)在醫(yī)學(xué)中的廣泛應(yīng)用，遺傳病的治療有了長(zhǎng)足的進(jìn)步，已從傳統(tǒng)的內(nèi)科治療（飲食療法、藥物療法、放射療法、康復(fù)療法）、外科治療等發(fā)展到基因治療。,基因治療,針對(duì)遺傳病患者缺陷的基因而實(shí)施的治療稱為基因治療(gene therapy).基因治

8、療是治療遺傳病的理想方法，只有糾正了致病基因才能達(dá)到根治的目的?，F(xiàn)代基因工程技術(shù)的發(fā)展，使基因治療成為可能，給遺傳病治療帶來(lái)了新的希望。,基因治療(gene therapy)是指應(yīng)用基因工程技術(shù)，更換、校正或增補(bǔ)缺陷基因，以達(dá)到治療遺傳病的目的?；蛑委熞部梢岳斫鉃閷⒄５挠泄δ艿幕蜣D(zhuǎn)移到患者體內(nèi)發(fā)揮功能，以糾正患者體內(nèi)所缺乏的蛋白質(zhì)或賦予機(jī)體新的功能。早在1989年，美國(guó)科學(xué)家羅森博格(Roseberg)等對(duì)5名惡性黑色素瘤患者進(jìn)行

9、了標(biāo)志基因轉(zhuǎn)移人體的首次臨床實(shí)驗(yàn)，表明體內(nèi)基因轉(zhuǎn)移對(duì)人體沒(méi)有傷害。1990年11月布萊斯(Blease)等成功進(jìn)行了世界首例腺苷脫氫酶(ADA)缺乏癥患者的基因治療。,迄今為止已有近幾十種遺傳病被列為基因治療的主要對(duì)象，如ADA缺乏癥、PNP免疫缺乏癥、囊性纖維瘤(CF) 、血友病、血紅蛋白病等，其中ADA基因缺乏所致的SEID病、CFI'R基因缺乏所致的CF疾病、LDLR基因缺乏所致的家族性高膽固醇血癥、凝血因子Ⅸ缺乏所致的血

10、友病B、葡萄糖腦苷脂酶基因(GO)缺乏所致的GD疾病等疾病研究已經(jīng)進(jìn)入了臨床試驗(yàn)階段，取得了不同程度的成功,,基因治療的步驟包括目的基因的克隆、目的基因的轉(zhuǎn)移、目的基因的表達(dá)、靶細(xì)胞的選擇和安全性問(wèn)題等。靶細(xì)胞的選擇根據(jù)所治療的遺傳病而定，大體可分為二類，即體細(xì)胞和生殖細(xì)胞體細(xì)胞基因治療有在體轉(zhuǎn)移和活體直接轉(zhuǎn)移兩種選徑，目前開(kāi)展的基因治療均用體細(xì)胞作為靶細(xì)胞。遺傳病中常用于基因治療的靶細(xì)胞有骨髓造血干細(xì)胞、皮膚成纖維細(xì)胞、

11、成肌細(xì)胞和肝細(xì)胞等。生殖細(xì)胞基因治療因涉及敏感的倫理學(xué)問(wèn)題，目前禁止仍人體試驗(yàn)。,目前常用的基因治療常有 以下幾種方法：,轉(zhuǎn)基因治療,是將正常的基因?qū)刖哂腥毕莼虻募?xì)胞內(nèi)，并整合到核DNA分子中，再表達(dá)相應(yīng)的遺傳信息，使原有的缺陷得到糾正，即傳統(tǒng)的目前主要開(kāi)展的基因治療。這種方法在理論上可以糾正遺傳性疾病，正在進(jìn)行大量的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，并越來(lái)越多地開(kāi)展人體實(shí)驗(yàn)治療。,基因修復(fù),原位修復(fù)是最理想的選擇，但目前尚很難做到，因?yàn)橐谌祟惢?/p>

12、組的某個(gè)特意部位上進(jìn)行重組是一個(gè)非常復(fù)雜的過(guò)程。即使在不太復(fù)雜的模式生物中進(jìn)行基因定位重組也不容易實(shí)現(xiàn)。,基因開(kāi)放,開(kāi)放類似功能的基因，以超過(guò)或代替異?；虻谋磉_(dá)。比如，通過(guò)去甲基化使已關(guān)閉的γ珠蛋白基因重新開(kāi)放，合成HbF，以代替HbA用于治療ß-地中海貧血癥。,基因抑制,導(dǎo)入外源基因以抑制原有的基因， 目的在于阻斷有害基因的表達(dá)。如向腫瘤細(xì)胞內(nèi)導(dǎo)入P53等腫瘤抑制基因以抑制癌基因的異常表達(dá)。,基因封閉反義RNA能封閉

13、mRNA，抑制基因的表達(dá)。免疫基因 將免疫因子（如腫瘤壞死因子、干擾素等）基因?qū)肽[瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞(TIL), 用于提高細(xì)胞的免疫功能，加強(qiáng)TIL細(xì)胞殺傷腫瘤細(xì)胞的能力。,基因?qū)敕椒?把外源基因安全有效地轉(zhuǎn)移到靶細(xì)胞中，是實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因治療的第一個(gè)關(guān)鍵步驟。常用方法有： 注射法 電穿孔法 微粒子轟擊法 化學(xué)法 載體介導(dǎo)轉(zhuǎn)移法 同源重組法,注射法,注射法是將DNA或DNA-載體直接注射到肌肉及其他器官，使鄰

14、近的細(xì)胞攝入DNA并進(jìn)行基因表達(dá)。 如通過(guò)肌肉注射將腺病毒運(yùn)載的目的基因轉(zhuǎn)移到骨骼肌細(xì)胞上治療犬模型B型血友病獲得滿意效果。,電穿孔法,電穿孔法(electroporation) 將靶細(xì)胞置于高壓脈沖電場(chǎng)中，通過(guò)電擊使細(xì)胞產(chǎn)生可逆性的穿孔，周圍基質(zhì)中的DNA可滲進(jìn)細(xì)胞。有用此法治療犬和鼠模型血友病B型的報(bào)道。,化學(xué)法,化學(xué)法是應(yīng)用磷酸鈣沉淀法改變細(xì)胞膜的通透性，以加強(qiáng)細(xì)胞從培養(yǎng)液中攝取外源DNA。但此法轉(zhuǎn)移效率低，其成功率

15、約在1／ 100 ～1／1000。,載體介導(dǎo)轉(zhuǎn)移法,病毒介導(dǎo)轉(zhuǎn)移法質(zhì)粒介導(dǎo)轉(zhuǎn)移法脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)移法聚乙烯亞胺介導(dǎo)轉(zhuǎn)移法,病毒介導(dǎo)轉(zhuǎn)移法,病毒介導(dǎo)轉(zhuǎn)移法(viral mediated gene transfer)是通過(guò)轉(zhuǎn)換方式完成基因轉(zhuǎn)移，即以病毒為載體，將外源目的基因通過(guò)基因重組技術(shù)，組裝于病毒上，讓這種重組病毒去感染受體宿主細(xì)胞，這種病毒稱為病毒運(yùn)載體(viral vector)，通常使用的病毒運(yùn)載體有腺病毒載體、慢病毒載體、腺相

16、關(guān)病毒載體、逆轉(zhuǎn)錄病毒載體、痘苗病毒載體等。,以腺病毒為載體研究進(jìn)行的囊性纖維變(cystic fibrosis，CF)轉(zhuǎn)基因治療在體外培養(yǎng)細(xì)胞中獲得了成功，即轉(zhuǎn)入的正?；蚣m正了CF的缺陷。 而如何將基因?qū)脒@些細(xì)胞并回到其功能位置，則是一件十分棘手的事，目前有報(bào)道提示噴霧法導(dǎo)入病毒運(yùn)載體避免了直接滴注法的許多不利因素，也優(yōu)于一般霧化吸入。,其他如腺相關(guān)病毒介導(dǎo)轉(zhuǎn)移法治療鼠Ⅶ型粘多糖增多癥模型，鼠A型血友病模型，鼠腦白質(zhì)營(yíng)養(yǎng)

17、障礙模型等。 用逆轉(zhuǎn)錄病毒載體治療鼠球狀細(xì)胞白質(zhì)營(yíng)養(yǎng)障礙，都使其臨床癥狀得到改善。,質(zhì)粒介導(dǎo)轉(zhuǎn)移法,質(zhì)粒介導(dǎo)轉(zhuǎn)移法是將含有目的基因的重組質(zhì)粒和某些細(xì)胞表面受體能識(shí)別的特異性多肽(配體)形成復(fù)合物，可通過(guò)細(xì)胞內(nèi)吞途徑達(dá)到轉(zhuǎn)移基因的目的。 例如在體外通過(guò)質(zhì)粒轉(zhuǎn)移凝固因子Ⅷ基因于皮膚成纖維細(xì)胞中再植入體內(nèi)治療重度A型血友病。,脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)移法,傳統(tǒng)上認(rèn)為脂質(zhì)體比病毒運(yùn)載體有較少的免疫反應(yīng),但因轉(zhuǎn)移效果不好，應(yīng)用受到限制，

18、有通過(guò)合成含有整合素基序和DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域的多肽提高轉(zhuǎn)移效果的報(bào)道。,微粒子轟擊法,微粒子轟擊法(microparticle bombardment) 利用亞微粒的鎢和金能吸附DNA，將它包裹起來(lái)形成微粒，通過(guò)物理途徑(一般應(yīng)用可調(diào)電壓產(chǎn)生的轟擊波)使它獲得很高的速度即基因槍技術(shù)，微粒瞬間即可進(jìn)入靶細(xì)胞，達(dá)到了轉(zhuǎn)移基因的目的，而又不損傷靶細(xì)胞原有的結(jié)構(gòu)。,聚乙烯亞胺介導(dǎo)轉(zhuǎn)移法,聚乙烯亞胺(Polyethylenimine PEI)是線狀

19、或支鏈多陽(yáng)離子聚合物和DNA形成復(fù)合物(PEI-DNA)，PEI-DNA已用于轉(zhuǎn)移DNA到不同組織。 有報(bào)道在鼠囊性纖維化模型中，通過(guò)噴霧將PEI-DNA傳送到肺組織中達(dá)到有效的治療效果。,同源重組法,同源重組法(homologous recombination)是將外源性目的基因定位或原位修補(bǔ)，導(dǎo)入的外源基因和染色體上的基因在同源順序間發(fā)生重組而插入染色體，這樣外源基因不是隨機(jī)地而是專一地整合到靶細(xì)胞的特定位點(diǎn)，取代原位點(diǎn)

20、上的缺陷基因。,目的基因的表達(dá),為了使目的基因良好表達(dá)，需在重組病毒上加上調(diào)控因子如啟動(dòng)子和增強(qiáng)子等，使整合入宿主的基因得到有效表達(dá)，產(chǎn)生所需的基因產(chǎn)物。,靶細(xì)胞選擇,實(shí)現(xiàn)基因治療要從患者體內(nèi)取出細(xì)胞經(jīng)體外培養(yǎng)、目的基因的轉(zhuǎn)移，然后重新返回人體產(chǎn)生治療效應(yīng)。因此，選擇靶細(xì)胞必須有一定條件，即： 易于取材，自體移植無(wú)排斥危險(xiǎn) 易于培養(yǎng)和導(dǎo)入基因 移植時(shí)不會(huì)因細(xì)胞老化而影響基因表達(dá) 重新植入后，能高速

21、血管化，便于釋放外源基因編碼的蛋白進(jìn)入血管。,因此靶細(xì)胞選用應(yīng)該是在體內(nèi)能保持相當(dāng)長(zhǎng)的壽命或者具有分裂能力的細(xì)胞，這樣才能使被轉(zhuǎn)入的基因能有效地、長(zhǎng)期地發(fā)揮“治療”作用。干細(xì)胞、前體細(xì)胞都是理想的轉(zhuǎn)基因治療靶細(xì)胞。如ADA缺乏癥、珠蛋白生成障礙性貧血、鐮狀細(xì)胞貧血、CGD等都以骨髓細(xì)胞作為靶細(xì)胞。 除了骨髓以外，肝細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、肌細(xì)胞、皮膚成纖維細(xì)胞、外周血淋巴細(xì)胞、也可作為靶細(xì)胞來(lái)研究或?qū)嵤┺D(zhuǎn)基因治療。,反義

22、寡核苷酸技術(shù),一些遺傳病和腫瘤往往是基因突變或過(guò)量表達(dá)而產(chǎn)生異常的蛋白質(zhì)所致，如果應(yīng)用DNA和RNA的堿基互補(bǔ)，可形成同源和異源雙鏈的原理，將這些突變基因轉(zhuǎn)錄的mRNA(DNA)阻斷在翻譯(或轉(zhuǎn)錄)前，使癥狀得到改善。即人為的制成反義核酸，使其和mRNA互補(bǔ)結(jié)合，阻止其翻譯成蛋白質(zhì)而達(dá)到治療疾病的目的。目前常用的就是將人工合成的反義寡核苷酸導(dǎo)入細(xì)胞，使它識(shí)別并結(jié)合到靶mRNA上，從而使之滅活。,下列幾種技術(shù)可達(dá)到治療的目的：

23、反義RNA表達(dá)載體 反義RNA(或DNA)的體外微注射，即人工合成或通過(guò)噬菌體RNA聚合酶產(chǎn)生靶基因的反義RNA，通過(guò)微注射入細(xì)胞達(dá)到抑制靶基因mRNA的目的 用脂質(zhì)體運(yùn)送反義RNA，脂質(zhì)體是由雙磷脂膜包圍的水相封閉的水泡，反義RNA即溶于其中然后注入體內(nèi) 其他方法，如利用CaCl2法或細(xì)胞打孔儀、逆病毒載體等導(dǎo)入反義RNA或DNA。,安全性問(wèn)題,安全性問(wèn)題是基因治療臨床實(shí)驗(yàn)前首先要重視的問(wèn)題。由于基因治療

24、尚未發(fā)展到定點(diǎn)整合以置換缺陷或有害基因的階段，目的基因在基因組中隨機(jī)整合有可能激活原癌基因或使腫瘤抑制基因失活，從而引起細(xì)胞癌變。,但在實(shí)際中遇到下列困難：①輸注的酶半減期短，難以持續(xù)生效；②注入的酶滯留血漿或組織間隙，難以進(jìn)入細(xì)胞發(fā)揮作用；③引起免疫反應(yīng)而失效或?qū)C(jī)體有副作用；④酶制劑難以大量供應(yīng)。為解決這些困難，目前采用的方法是：（a）酶的誘導(dǎo)。因?yàn)橛械拿溉狈Σ⒎潜旧斫Y(jié)構(gòu)基因突變，而是由于調(diào)節(jié)失靈，故通過(guò)藥物、激素或營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)可誘導(dǎo)合