五高血壓的基因研究與基因治療進展

1、高 血 壓 的 基 因 研 究與 基 因 治 療 進 展,綠色包裝與生物納米技術(shù)實驗室,高血壓是一種以體循環(huán)動脈收縮壓（SBP）和（或）舒張壓（DBP）升高為特征的臨床綜合征，它是目前臨床最常見、最重要的心血管疾病之一 。,第一節(jié) 高血壓的基因研究,,血壓及高血壓,血壓的形成血容量血管張力心輸出量,高血壓的形成血容量過多血管張力增加心輸出量上升,,,,,,美國高血壓預防、評價和治療聯(lián)合委員會第六次會議報告：　 理想血壓：

2、<120/80mmHg 正常血壓：<130/85mmHg 正常高限：<130～139/85～89mmHg 高血壓：≥140/90mmHg (18.7/12.0kPa),高血壓： 1級：收縮壓140-159 mmHg 或舒張壓90-99 mmHg

3、 2級：收縮壓160-179 mmHg 或舒張壓100-109 mmHg 3級：收縮壓≥180 mmHg 或舒張壓≥110 mmHg,高血壓,原發(fā) : 90%,繼發(fā):10% 腎臟疾病、內(nèi)分泌疾病如嗜鉻細胞瘤等,,高 血 壓 的 病 因,（1）由于血壓升高促成心肌細胞肥大→心臟

4、肥厚或擴大→瓣膜閉合不嚴→血液回流→心力衰竭。2）由于血壓升高→腦部血管缺血形成動脈硬化→腦血栓或腦出血。（3）由于血壓升高→腎小球壓力升高→腎小球萎縮→腎動脈硬化缺血→腎功能衰竭。（4）長期高血壓或血壓急驟增高→視網(wǎng)膜滲血和出血,直接并發(fā)癥,,二、體液調(diào)節(jié)：腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng),一、神經(jīng)調(diào)節(jié)：交感神經(jīng)系統(tǒng),對高血壓形成密切關(guān)聯(lián)的主要候選基因,一、腎素血管緊張素系統(tǒng) (Renin - Angiotensin Syste

5、m, RAS) 腎素是一種蛋白分解酶,主要在腎內(nèi)但也可在腎外組織合成、儲存和分泌,它本身無生理活性,其作用在于激活由肝臟合成的血管緊張素原（AGT）,使其轉(zhuǎn)化為血管緊張素Ⅰ,并在血管緊張素轉(zhuǎn)換酶(ACE)的作用下水解形成血管緊張素Ⅱ(ATⅡ)。ACE還能裂解緩激肽(bradykinin,BK) 等,從而使ATⅡ增加,使BK等抗高血壓物質(zhì)失活而升高血壓。,AT1和AT2受體的功能,二、激肽釋放酶-激肽系統(tǒng) 緩激肽是體內(nèi)

6、最強的血管舒張物質(zhì)之一。緩激肽通過與緩激肽β2受體結(jié)合可引起全身小動脈舒張，顯著降低外周血管循環(huán)阻力，血管通透性增強，從而引起血壓下降。,緩激肽β2受體基因可能是原發(fā)性高血壓等心血管疾病的致病候選基因之一。緩激肽β2受體基因啟動子區(qū)域存在T-58C多態(tài)性，其-58C等位基因突變使受體數(shù)目減少，血管的舒張能力降低，產(chǎn)生高血壓。,三、交感神經(jīng)-腎上腺素系統(tǒng),交感神經(jīng)引起血壓升高的機制：,①作用于血管α受體，使小動脈收縮，增大外周阻力②

7、通過興奮心臟的β受體使心臟收縮加強、加快，從而提高心輸出量；③直接或間接激活RAS系統(tǒng)進而收縮血管和通過血管緊張素Ⅱ（angiotensinⅡ,AngⅡ）促進醛固酮分泌，增加血容量 。,β2腎上腺素受體遺傳多態(tài)性可能參與高血壓的發(fā)病機制。目前在β2腎上腺素受體基因的啟動和編碼區(qū)共報道了17個單核苷酸多態(tài)性，其中G16R多態(tài)性很常見。,四、G蛋白& 信號傳導系統(tǒng),G蛋白信號調(diào)節(jié)因子可與多種心血管激素（ 如血管緊張素和去甲腎上

8、腺素） 偶連。G蛋白亞基編碼基因多態(tài)性對心血管系統(tǒng)有明顯影響。其中G蛋白β3亞基基因多態(tài)性被認為是研究心血管藥物基因組學最佳候選基因。,文獻報道，G蛋白β3亞基基因第10 外顯子825 位存在C→T 核苷酸轉(zhuǎn)換， 825T等位基因與白種人高血壓相關(guān)。,第二節(jié) 高血壓的基因治療研究,一、基因治療的概念 基因治療指將正常和野生型的基因插入靶細胞的染色質(zhì)基因組中, 以補充缺失基因或置換致病基因, 從而產(chǎn)生新的表型的一種治療方法。,基因

9、治療的臨床應(yīng)用,1991年，美國向一患先天性免疫缺陷?。ㄟz傳性腺苷脫氨酶ADA基因缺陷）的4歲女孩體內(nèi)導入重組的ADA基因，獲得成功。1994年，中國用導入人凝血因子Ⅸ基因的方法成功治療了乙型血友病的患者。,二、基因治療的基本程序,治療性基因的選擇,基因載體的選擇,靶細胞的選擇,基因轉(zhuǎn)移,外源基因表達的篩選 利用在體中的標記基因,回輸體內(nèi),病毒載體非病毒載體,體細胞生殖細胞,間接體內(nèi)療法直接體內(nèi)療法,回體轉(zhuǎn)移法,在體直接轉(zhuǎn)移法

10、,三、基因治療的基本策略( 1 ) 基因置換：是用有功能的正?；蛑脫Q致病基因, 達到徹底治愈。( 2) 基因修正：將突變堿基序列修正, 正常序列保留, 恢復其正常功能。,( 3)基因修飾：是將目的基因?qū)肴毕菁毎蚱渌毎? 目的基因的表達產(chǎn)物可修飾和改變?nèi)毕菁毎墓δ芑蚴乖泄δ芗訌姟? 4) 基因失活：就是運用反義技術(shù)特異封閉某些基因的表達,以達到抑制某些有害基因的表達。,原發(fā)性高血壓發(fā)病涉及多個基因, 具體缺陷基因仍未徹

11、底闡明, 現(xiàn)在還不能通過基因置換和基因修正來達到徹底治愈高血壓的。目前的基因治療還停留在使用基因修飾和失活的方法增強舒血管物質(zhì)的表達及減少縮血管物質(zhì)的表達, 以達到類似藥物降壓的效果。,高血壓基因治療的策略主要有兩種:1) 降低基因表達( knockdown) : 以能升高血壓和加速心血管病理的基因為主, 特別是腎素血管緊張素系統(tǒng)(RAS) ; 2) 誘導基因表達( over-expression) : 以降低血壓有關(guān)的基因為

12、靶基因, 如心房利鈉肽、內(nèi)皮型一氧化氮等。,四、高血壓與縮血管基因的抑制,（一）降低基因表達的反義技術(shù) 反義技術(shù)是根據(jù)靶基因結(jié)構(gòu)特點設(shè)計反義寡核苷酸(antisenseoligonucleotide,ASODN ) 分子，導入靶細胞或機體后與DNA或mRNA分子雜合, 從而封閉或抑制特定基因的復制或轉(zhuǎn)錄，減少一些致高血壓蛋白質(zhì)的形成。,血管緊張素原( angiotensinogen, AGT) 是RAS 系統(tǒng)中的重要成員之一,參與

13、血管緊張素的形成和高血壓的產(chǎn)生。2011 年Kmiura 等利用重組腺病毒作載體攜帶的AGT基因的ASODN, 試驗中給予5d齡的(spontaneously hypertensive rats,SHR)大鼠一次心內(nèi)注射該載體, 可延遲發(fā)生高血壓91d, 治療中收縮壓可下降23mmHg, 且轉(zhuǎn)染后ASODN 在肝、腎、心臟中穩(wěn)定發(fā)揮作用, 明顯降低肝臟中AGT水平, 減輕左室心肌肥厚。,1 .血管緊張素原反義基因療法,2.Ⅰ型血管緊

14、張素Ⅱ受體( AT ⅠR) 基因反義基因療法 ATⅠR和血管緊張素Ⅱ結(jié)合, 產(chǎn)生強大的縮血管效應(yīng) Wang等用反轉(zhuǎn)錄病毒攜帶AT1R-ASODN轉(zhuǎn)染細胞，在體外及SHR體內(nèi)試驗中均能明顯降低AngII效用, 達到降低血壓的目的。,3.血管緊張素轉(zhuǎn)換酶反義基因療法血管緊張素轉(zhuǎn)換酶(ACE) 能使無活性的血管緊張素Ⅰ末端裂解2個氨基酸, 形成強烈的收縮血管物質(zhì)AngⅡ, 引起血壓升高。Wang等以逆轉(zhuǎn)錄病毒為

15、載體將ACE-ASODN心內(nèi)注射給5日齡的SHR, 結(jié)果發(fā)現(xiàn), 產(chǎn)生的降壓作用明顯而持久, BP降低13-17mmHg, 并且能夠減輕心室肥大, 阻斷腎臟和血管內(nèi)皮的病理性變化。,4.其他一些基因, 如酪氨酸羥基酶、β1腎上腺素能受體、血管緊張素基因活化素等基因的ASODN 也都是有降低血壓作用。,（二）降低基因表達的RNA干擾技術(shù)RNA 干擾( RNA interference, RNAi) , 是近年才發(fā)現(xiàn)的自然界進化上高度保守

16、而普遍存在的一種現(xiàn)象, 是一種重要的轉(zhuǎn)錄后基因沉默機制。,在設(shè)計小干擾性RNA的靶位點時，應(yīng)盡量選擇對靶mRNA特異、而與其他內(nèi)源性基因無同源性的核苷酸序列。 小干擾性RNA誘發(fā)的基因抑制具有高度的序列特異性。在小干擾性RNA上一個錯配的堿基對即可使其失去原有的抑制基因表達的活性。換言之，只有與小干擾性RNA高度同源的mRNA才會被降解。這一特性在將RNA干擾技術(shù)用于治療人類疾病時極為重要，為減少或避免抑制不相關(guān)基因奠定了基礎(chǔ)。,W

17、ang 等用針對腎上腺鹽皮質(zhì)激素受體(mineralcorticoid receptor, MR) 的重組子腺相關(guān)病毒攜帶短發(fā)夾小干擾RNA ( AAV. MR-shRNA) 來檢測其對腎鹽皮質(zhì)激素受體的抑制和對冷誘導高血壓( cold-induced hyper tension, CIH) 的控制能力。結(jié)果發(fā)現(xiàn), AAV.MR-shRNA 治療組CIH 大鼠在基因?qū)牒?周內(nèi)血壓無增高，單劑量注射AAV.MR-shRNA 的大鼠其抗高

18、血壓作用至少維持3 周。,(三)降低基因表達的圈套技術(shù) 基本原理是:合成與順式元件相一致的雙鏈寡聚脫氧核苷酸(oligodeoxynucleotides,ODNs),被稱為圈套ODNs,轉(zhuǎn)染入細胞,競爭性抑制反式因子轉(zhuǎn)錄因子)與順式元件的結(jié)合,干擾轉(zhuǎn)錄因子的DNA結(jié)合活性及其后續(xù)基因的表達。,圈套策略示意圖在正常狀態(tài)下，轉(zhuǎn)錄因子（TF）與順式元件（Cis-E）結(jié)合，導致靶基因的持續(xù)表達。與順式元件序列一致的圈套寡核苷酸（de

19、coys ODNs）能結(jié)合 TF，阻止TF與Cis-E的相互作用，抑制靶基因的轉(zhuǎn)錄表達。,反義ODN和圈套ODN的作用原理,Transfection of decoy but not mismatched ODN against AGE resulted in a transient decrease in blood pressure of spontaneously hypertensive rats (SHR), acco

20、mpanied by a reduction in plasma angiotensinogen and angiotensin II levels.,Morishita R, Higaki J, Tomita N, Aoki M, Moriguchi A, Tamura K,Murakami K, Kaneda Y, Ogihara T. Role of transcriptional cis-elements,angiotens

21、inogen gene–activating elements, of angiotensinogen gene inblood pressure regulation. Hypertension. 1996;27:502–507.,(AGE) 2：The transcriptional cis-elements, angiotensinogen gene–activating elements,五、高血壓與“擴血管基因”增強,1.激

22、肽釋放酶( kallikrein)基因療法 激肽釋放酶是體內(nèi)的一類蛋白酶, 可使底物激肽原分解為緩激肽。緩激肽具有舒張血管活性, 可參與對血壓和局部組織血流的調(diào)節(jié)。在人體和動物實驗中證實, 緩激肽是目前已知的最強的舒血管物質(zhì)之一。,Eric 等給予高血壓大鼠模型靜脈注射以腺病毒為載體的人組織激肽釋放酶基因后，延遲BP升高時間達2 d, 并且降壓作用持續(xù)約23 d。注射人組織激肽釋放酶基因的大鼠的最大降壓幅度可達50 mm

23、 Hg ( 1 mm Hg= 0. 133 kPa) , 最小降壓幅度也可達32 mm Hg。,Eric D, Hideaki Y, Chao JL, et al . Adenovirus􀀁mediated kall ikrein gene delivery hypertension and protects against renal injury in deoxy-coritcosterone salt rats[

24、 J] . Immunopharmacology, 1999, 44( 1- 2) : 57.,2. 腎上腺髓質(zhì)素( adrenomedulin, ADM)基因療法 人類的腎上腺髓質(zhì)素由52個氨基酸組成, 在體內(nèi)具有舒張血管、促尿鈉排泄和強心等作用。,Wei 等將雙鏈腺相關(guān)病毒為載體的人ADM cDNA 通過尾靜脈注射入成年SHR, 兩周后收縮壓明顯下降, 此作用持續(xù)時間長達16 周。左室肥厚和心肌纖維化、腎小球硬化、腎小管損

25、害程度均明顯降低。,Wei X, Zhao C, Jiang J , et al. Ad renomedullin gene delivery alleviat es hypert ensi on and it s secondary injuries of cardiovascular system[ J] . Hum Gene T her, 2005, 16: 372􀀁380.,3. 心房利尿肽( atrial n

26、atriuretic peptide, ANP) 基因療法 ANP 主要是由心房肌細胞合成和釋放,通過舒張血管, 降低外周阻力, 增加腎小球濾過率，抑制腎素的釋放, 引起明顯的尿鈉和尿量增加等作用機制, 達到降低BP的效果。,Lin 等給鹽敏感性高血壓腦卒中大鼠靜脈注射以腺病毒為載體的ANP 基因, 平均血壓可大幅度降低, 腦卒中的死亡率可從54%下降至17% , 心肌肥厚和血管肥厚明顯減輕。,Lin KF,

27、Chao J, Chao L. Atrial natriuretu peptide gene delivery reduces stroke induced mortality rate in Dahl salt sensit ive rats [ J ] . Hypertension, 1999, 33(1pt2) : 219.,4.其他基因療法􀀂轉(zhuǎn)染其他基因, 如一氧化氮合酶基因、血紅素加氧酶基因、腎素結(jié)合蛋白基因