扇貝雌核發(fā)育四倍體和異源四倍體的誘導(dǎo)及其細(xì)胞遺傳學(xué)研究.pdf

1、本文采用遺傳滅活的長牡蠣(Crassostrea glgas)精子誘導(dǎo)櫛孔扇貝(Chlamysfarreri)異精雌核發(fā)育四倍體；采用種間雜交方法誘導(dǎo)櫛孔扇貝(C.farreri♀)×蝦夷扇貝(Patinopecten yessoensis♂)異源四倍體。采用染色體制片技術(shù)、早期胚胎壓片技術(shù)、組織切片技術(shù)、熒光(免疫熒光)顯微觀察、基因組熒光原位雜交技術(shù)(GISH)等細(xì)胞遺傳學(xué)手段對(duì)以上兩種技術(shù)誘導(dǎo)扇貝的四倍體及其細(xì)胞遺傳學(xué)進(jìn)行了研究，

2、為貝類四倍體的誘導(dǎo)提出了新的研究思路。研究內(nèi)容及結(jié)果如下： 第一部分：采用遺傳失活的長牡蠣精子誘導(dǎo)櫛孔扇貝異精雌核發(fā)育四倍體 1.1長牡蠣精子的遺傳滅活：采用強(qiáng)度為1500uw/cm<'2>的紫外線照射長牡蠣精子，使其失去遺傳活性，然后與櫛孔扇貝卵子授精，誘導(dǎo)櫛孔扇貝異精雌核發(fā)育單倍體。受精率、早期胚胎成活率和單倍體率結(jié)果表明，1500uw/cm<'2>的紫外線照射長牡蠣精子60s是獲得櫛孔扇貝異精雌核發(fā)育單倍體的適宜條

3、件。隨著照射時(shí)間的延長，受精率明顯下降，早期胚胎成活率呈現(xiàn)"Hertwig"效應(yīng)。 1.2櫛孔扇貝異精雌核發(fā)育四倍體的誘導(dǎo)：遺傳失活的長牡蠣精子與櫛孔扇貝卵子授精，50mg/L 6-二甲基氨基嘌呤(6-DMAP)抑制受精卵第一極體和第二極體的排出，持續(xù)處理35min。采用滴片法對(duì)誘導(dǎo)后代擔(dān)輪幼蟲進(jìn)行倍性分析，結(jié)果表明：誘導(dǎo)后代幼蟲的倍性復(fù)雜，包括四倍體(6.25％)、單倍體(8.33％)、二倍體(13.54％)、三倍體(5.21

4、％)和大量的非整倍體(66.67％)。說明采用本方法能夠誘導(dǎo)出一定比例的雌核發(fā)育四倍體。 1.3細(xì)胞學(xué)觀察：分別采用二脒基苯基吲哚(DAPI)熒光染色和石蠟切片法在顯微鏡下觀察櫛孔扇貝異精雌核發(fā)育四倍體在受精和早期胚胎發(fā)育過程中的核行為變化。結(jié)果表明：被遺傳滅活的長牡蠣精子能夠與櫛孔扇貝卵子正常受精，但發(fā)育速度較對(duì)照組緩慢。遺傳滅活的長牡蠣精核進(jìn)入櫛孔扇貝卵子后發(fā)生輕微膨脹，至原核形成期，四倍性雌核發(fā)生融合。在此過程中，精核一直

5、處于凝縮狀態(tài)，不解凝，不形成雄性原核。在第一次卵裂中期，精核形成一致密的染色質(zhì)小體(DCB)，位于兩組分開的母本染色體之間，不參與核分裂；第一次卵裂結(jié)束時(shí)DCB滯留于兩卵裂球的分裂溝上或進(jìn)入其中一分裂球中；第二次卵裂過程中，DCB的去向與第一次卵裂時(shí)基本一致。同時(shí)觀察到多種倍性的胚胎、核物質(zhì)分離紊亂、染色體呈現(xiàn)多極分離現(xiàn)象，并對(duì)這些現(xiàn)象進(jìn)行了分析。 第二部分：櫛孔扇貝(♀)與蝦夷扇貝(♂)雜交誘導(dǎo)扇貝異源四倍體 2.1扇

6、貝異源四倍體的誘導(dǎo)及條件優(yōu)化：采用壓片、滴片、流式細(xì)胞術(shù)對(duì)扇貝異源四倍體誘導(dǎo)后代的倍性構(gòu)成進(jìn)行分析。綜合受精率、D形幼蟲率、幼蟲的發(fā)育狀況及倍體比率等參數(shù)，本實(shí)驗(yàn)得出50mg/L 6-DMAP持續(xù)處理異源受精卵15min抑制第一極體的釋放為適宜誘導(dǎo)組合。流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果表明處理15min誘導(dǎo)組獲得17.30％的四倍體，染色體滴片結(jié)果表明處理15min誘導(dǎo)組獲得6.84％的四倍體，兩種技術(shù)獲得結(jié)果差異較大，對(duì)其原因進(jìn)行了分析。

7、2.2染色體分離行為的細(xì)胞學(xué)觀察：結(jié)果發(fā)現(xiàn)，6-DMAP抑制異源受精卵第一極體的釋放改變了正常的染色體分離行為。在第二次減數(shù)分裂過程中出現(xiàn)了多種分離方式，其中"聯(lián)合二極分離"所占比例最多，為75.50％；"三極分離"占7.39％； "獨(dú)立二極分離"占6.20％；其它為"紊亂分離"，占10.91％。染色體分離方式結(jié)合倍性結(jié)果綜合分析表明："獨(dú)立二極分離"是形成四倍體的主要機(jī)制；而"聯(lián)合二極分離"、"三極分離"與"紊亂分離"將主要形成非整倍

8、體。另外，對(duì)各種分離模式形成的機(jī)制進(jìn)行了探討。 2.3早期胚胎核行為觀察：DAPI染色熒光顯微觀察結(jié)果發(fā)現(xiàn)排放1個(gè)極體、排放2個(gè)極體和不排放極體三種類型的受精卵，所占比例依次為54.35％、30.9％和14.75％。依據(jù)極體的排放情況將分別導(dǎo)致產(chǎn)生二倍體、三倍體、四倍體、五倍體和非整倍體。觀察中還發(fā)現(xiàn)核物質(zhì)分離紊亂及雌核發(fā)育等現(xiàn)象。 2.4早期胚胎紡錘體和染色體分離行為：對(duì)免疫熒光固定液及其緩沖液體系進(jìn)行篩選，結(jié)果表明0

9、.2M PBS(pH7.4)配制的4％多聚甲醛固定液為適宜的固定液體系。采用異硫氰酸熒光素(Fluorescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC)標(biāo)記的抗α管蛋白(anti-α-tubulin)特異性地標(biāo)記紡錘體，同時(shí)采用碘化丙錠PI(Propidiumiodide)標(biāo)記染色體，顯微觀察表明：在成熟受精卵開始受精到第二次卵裂過程中，整個(gè)細(xì)胞的微管骨架發(fā)生了劇烈變化。同時(shí)發(fā)現(xiàn)染色體多極分離現(xiàn)象，與壓片法觀察結(jié)果相一致，主要為"三

10、極分離"和"獨(dú)立二極分離"。染色體核行為變化同DAPI熒光染色觀察結(jié)果相似，同時(shí)也在早期胚胎中發(fā)現(xiàn)個(gè)別雌核發(fā)育胚胎。 2.5誘導(dǎo)后代的細(xì)胞遺傳學(xué)分析：采用GISH技術(shù)結(jié)合染色體滴片技術(shù)對(duì)扇貝異源四倍體誘導(dǎo)后代的染色體遺傳構(gòu)成進(jìn)行研究，對(duì)授精后17h～66h內(nèi)6個(gè)時(shí)間段各300多個(gè)分裂相進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。結(jié)果表明，誘導(dǎo)異源四倍體過程中產(chǎn)生了多種倍性的幼蟲，包括5.192％的四倍體、16.577％的三倍體以及單倍體、二倍體、五倍體和大量