褪黑素對人肺腺癌A549細胞的影響.pdf

1、背景：
　　肺癌在全世界各個國家發(fā)病率都很高，且轉(zhuǎn)移率死亡率也很高，其早期診斷率低，發(fā)現(xiàn)時多屬中晚期，雖然治療方法多樣，各種治療方法療效均不佳，5年生存率低。近年來在體內(nèi)外的研究中發(fā)現(xiàn)褪黑素有明確的抗腫瘤作用。但是關于褪黑素與肺癌關系的研究不多。核轉(zhuǎn)錄因子κB是一種重要的細胞因子，活化后能從胞漿移位進入核內(nèi)，與目的DNA結(jié)合，調(diào)節(jié)下游相關基因的轉(zhuǎn)錄。在腫瘤細胞中核轉(zhuǎn)錄因子κB通常處于異?；罨癄顟B(tài)，與腫瘤的增殖、遷移、侵襲等生物學過

2、程密切相關，抑制其活性已成為腫瘤治療的方向之一。
　　臨床觀察中發(fā)現(xiàn)，褪黑素能增強化療療效、提高晚期肺癌患者生存率，但未見相關的機制研究。有關細胞的研究發(fā)現(xiàn)，褪黑素對核轉(zhuǎn)錄因子κB的活性有抑制作用，肺癌的研究中未見報道。我們推測褪黑素可能通過抑制腫瘤細胞核轉(zhuǎn)錄因子κB活性來發(fā)揮抗腫瘤作用，因此我們設計在體外培養(yǎng)人肺腺癌A549細胞，以不同濃度的褪黑素干預，觀察細胞的增殖、遷移、侵襲的情況，明確褪黑素對非小細胞肺癌的作用，并測定轉(zhuǎn)錄

3、因子κB的核移位情況，從而推斷轉(zhuǎn)錄因子κB在褪黑素抗腫瘤過程中的作用。
　　第一部分：褪黑素對體外肺腺癌A549細胞增殖的影響
　　目的：探討褪黑素對體外肺腺癌A549細胞增殖的影響，并初步探討其可能的作用路徑。
　　方法：體外培養(yǎng)人肺腺癌 A549細胞，將細胞分為5組，分別用含5mmol/L、2.5mmol/L、1mmol/L、0.1mmol/L、0mmol/L的褪黑素的培養(yǎng)液培養(yǎng)。1、用噻唑藍（MTT）法測24h、

4、48h、72h的增殖情況；2、DNA末端原位標記染色法（TUNEL）檢測各濃度褪黑素干預48h后細胞凋亡情況；3、免疫組織化學方法初步判斷各組細胞干預48h后核轉(zhuǎn)錄因子κB的核移位情況；4、Western-blot方法測定各組細胞干預48h后抗凋亡相關蛋白Bcl2和凋亡相關蛋白Caspase3表達情況。
　　結(jié)果：1、高濃度的褪黑素能夠直接抑制人肺腺癌A549細胞的增殖，低濃度的褪黑素對增殖無明細影響，隨著時間的延長，抑制作用增強

5、。2、高濃度褪黑素干預后細胞凋亡率明顯提高，低濃度無明顯影響。3、免疫組化結(jié)果顯示，高濃度褪黑素干預后細胞核內(nèi)核轉(zhuǎn)錄因子κBp65陽性率降低。4、褪黑素能夠調(diào)節(jié)Bcl2、Caspase3蛋白的表達，隨著褪黑素濃度的升高，Bcl2蛋白表達水平降低、Caspase3表達水平升高。
　　結(jié)論：褪黑素能夠呈劑量-時間依賴性的抑制人A549細胞的體外增殖，作用機制可能是褪黑素通過抑制NF-κB的核移位調(diào)節(jié)Bcl2、Caspase3等蛋白的表

6、達增加細胞的凋亡率。
　　第二部分：褪黑素與多柔比星對肺腺癌 A549細胞的協(xié)同作用及褪黑素對細胞遷移、侵襲能力的影響
　　目的：探討褪黑素與常用化療藥物多柔比星聯(lián)合用藥對肺腺癌A549細胞的作用，并觀察褪黑素對肺腺癌A549細胞遷移、侵襲能力的影響。
　　方法：1、將體外培養(yǎng)的人肺腺癌A549細胞分為9組，分別用0mmol/L、0.1mmol/L、1mmol/L褪黑素與0ug/ml、0.2ug/ml、2ug/ml多柔

7、比星組合干預48h，噻唑藍（MTT）法測定細胞增殖情況；2、細胞劃痕法檢測0mmol/L、0.1mmol/L、0.5mmol/L、1mmol/L褪黑素對肺腺癌A549細胞遷移能力的影響；3、Transwell侵襲小室測定法分析0mmol/L、0.1mmol/L、0.5mmol/L、1mmol/L褪黑素對肺腺癌A549細胞侵襲能力的影響；4、Western-blot法檢測0mmol/L、0.1mmol/L、0.5mmol/L、1mmol/

8、L褪黑素對A549細胞核轉(zhuǎn)錄因子Bp65核移位的影響。
　　結(jié)果：1、0.1mmol/L、1mmol/L褪黑素單獨使用48h對肺腺癌A549細胞無明顯抑制增殖的作用，與多柔比星合用時可明顯提高多柔比星對細胞的抑制作用。2、劃痕實驗結(jié)果顯示褪黑素對細胞的遷移能力有抑制作用，且呈劑量依賴性。3、Transwell侵襲小室測定實驗顯示褪黑素對細胞的侵襲能力有抑制作用，隨著濃度增加抑制作用增強。4、Western-blot結(jié)果提示褪黑素能