IER5在輻射及順鉑誘導(dǎo)人肝癌HepG2細(xì)胞凋亡中的作用.pdf

1、原發(fā)性肝癌，是我國(guó)最常見的惡性腫瘤之一，年死亡率居我國(guó)惡性腫瘤死亡率第三位。近年來(lái)，隨著三維適型放療及調(diào)強(qiáng)放療技術(shù)的發(fā)展，放療在肝癌治療中發(fā)揮越來(lái)越重要的作用。放射治療，簡(jiǎn)稱放療，是通過高能放射線照射來(lái)殺滅細(xì)胞的一種治療方法。放射線輻射細(xì)胞后，激活細(xì)胞氧化應(yīng)激反應(yīng)，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。DNA降解是細(xì)胞凋亡的一個(gè)顯著特征，也是輻射造成細(xì)胞損傷的主要目標(biāo)。增加腫瘤細(xì)胞的輻射敏感性，可增加腫瘤的放療療效，輻射敏感性直接作用于細(xì)胞周期的G2期，使細(xì)胞

2、周期阻滯于G2/M期，阻止細(xì)胞有絲分裂，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。輻射敏感性受輻射敏感基因調(diào)控，多年來(lái)學(xué)者們致力于尋找腫瘤的輻射敏感基因，來(lái)增加腫瘤細(xì)胞的輻射敏感性，進(jìn)而增強(qiáng)腫瘤的放療療效并減少放療的副作用。
　　 IER5屬于早期慢反應(yīng)基因，由于IER5在細(xì)胞周期中的特定表達(dá)，故其在細(xì)胞周期調(diào)控中起一定作用。我們前期研究發(fā)現(xiàn)，輻射可增強(qiáng)IER5的轉(zhuǎn)錄水平，IER5表達(dá)增加可使離體培養(yǎng)人肝癌HepG2細(xì)胞對(duì)輻射損傷修復(fù)能力減弱，增加HepG

3、2細(xì)胞的輻射敏感性。半胱天冬酶(caspase)是細(xì)胞凋亡的主要蛋白酶。Akt是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，能抑制半胱天冬酶-9(caspase-9)的活性，通過依賴和不依賴Caspase選擇性地降低細(xì)胞活性致細(xì)胞凋亡。
　　 目前關(guān)于IER5在輻射誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡中的作用及作用機(jī)制國(guó)內(nèi)外尚乏報(bào)道。許多化療藥物主要通過激活caspase促進(jìn)細(xì)胞凋亡。順鉑類化療藥物是肝動(dòng)脈化療栓塞的常用藥物之一。IER5對(duì)順鉑誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡是否有影

4、響，國(guó)內(nèi)外尚無(wú)報(bào)道。本文采用穩(wěn)定轉(zhuǎn)染篩選單克隆技術(shù)、免疫印記技術(shù)、流式細(xì)胞術(shù)等方法進(jìn)一步探討IER5與肝癌輻射敏感性之間的關(guān)系，研究其在輻射及順鉑誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞凋亡中的作用及機(jī)制，期望為增加肝癌放化療敏感性尋找到新的作用靶點(diǎn)，從而改善肝癌患者的預(yù)后及生存質(zhì)量。
　　 目的：本研究以離體肝癌HepG2細(xì)胞為研究對(duì)象，采用穩(wěn)定轉(zhuǎn)染篩選單克隆技術(shù)，轉(zhuǎn)染HepG2，建立IER5基因過表達(dá)細(xì)胞模型。采用細(xì)胞計(jì)數(shù)、MTT比色法、流式細(xì)胞

5、術(shù)及蛋白免疫印跡技術(shù)研究IER5在輻射調(diào)控HepG2細(xì)胞增殖、存活、細(xì)胞周期分布及凋亡中的作用及作用機(jī)制。同時(shí)應(yīng)用免疫印跡技術(shù)對(duì)IER5在順鉑誘導(dǎo)人肝癌HepG2細(xì)胞凋亡中的作用進(jìn)行了研究。
　　 方法：
　　 1 構(gòu)建IER5過表達(dá)細(xì)胞系：用脂質(zhì)體2000TM在人肝癌HepG2細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染IER5-3xFlag基因或空載體Pcmv-3xFlag Vector，構(gòu)建穩(wěn)定轉(zhuǎn)染IER5基因的細(xì)胞系（HepG2/IER5），

6、并將轉(zhuǎn)染空載體的細(xì)胞(HepG2/Vector)作為對(duì)照組，采用免疫印跡法檢測(cè)IER5蛋白表達(dá)。
　　 2 研究IER5基因表達(dá)增加對(duì)輻射后HepG2細(xì)胞增殖、存活能力、細(xì)胞周期的影響：①將HepG2/IER5細(xì)胞和HepG2/Vector細(xì)胞分別接受0Gy、4Gy60Co-γ射線照射，應(yīng)用細(xì)胞計(jì)數(shù)方法檢測(cè)IER5在輻射影響HepG2細(xì)胞增殖中的作用。②通過MTT法檢測(cè)細(xì)胞存活率，研究IER5對(duì)輻射后HepG2細(xì)胞存活能力的影響

7、。③采用流式細(xì)胞術(shù)研究IER5對(duì)輻射后HepG2細(xì)胞細(xì)胞周期的影響。
　　 3 研究IER5在γ射線及順鉑誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞凋亡中的作用及作用機(jī)制：采用蛋白免疫印跡方法檢測(cè)凋亡蛋白和凋亡通路相關(guān)蛋白的表達(dá)。
　　 結(jié)果：
　　 1 構(gòu)建IER5過表達(dá)細(xì)胞系(HepG2/IER5)（見Fig1）：Western Blotting檢測(cè)結(jié)果顯示：相對(duì)于HepG2/Vector細(xì)胞，IER5蛋白在HepG2/IER5表達(dá)

8、水平明顯升高，說(shuō)明HepG2/IER5過表達(dá)細(xì)胞系構(gòu)建成功。
　　 2 IER5過表達(dá)能抑制HepG2增殖并增強(qiáng)輻射對(duì)HepG2細(xì)胞增殖的抑制作用（見Fig2）：在未照射組及照射組，與HepG2/Vector細(xì)胞相比，HepG2/IER5細(xì)胞生長(zhǎng)速度均明顯減慢(P＜0.05)，說(shuō)明增加IER5表達(dá)能抑制HepG2增殖，增強(qiáng)輻射對(duì)HepG2細(xì)胞增殖的抑制作用。
　　 3 IER5過表達(dá)加強(qiáng)了輻射對(duì)HepG2細(xì)胞存活的抑制作

9、用（見Fig3）：γ-射線照射后24小時(shí)及48小時(shí)HepG2/IER5細(xì)胞存活率明顯低于HepG2/Vector細(xì)胞(P＜0.01)。且輻射后24小時(shí)的HepG2/IER5細(xì)胞比未照射組HepG2/IER5細(xì)胞的存活率亦明顯降低(P＜0.01)。說(shuō)明增加IER5表達(dá)能降低HepG2細(xì)胞存活率，增強(qiáng)輻射對(duì)HepG2細(xì)胞存活的抑制作用。
　　 4 IER5過表達(dá)能使輻射后的HepG2細(xì)胞周期阻滯在G2/M期（見Fig4）：未照射組細(xì)

10、胞及照射組HepG2/Vector細(xì)胞在各周期的DNA含量無(wú)明顯差異；γ-射線照射后12小時(shí)（P＜0.01）和24小時(shí)（P＜0.05），HepG2/IER5細(xì)胞與對(duì)照組相比，隨G0/G1期或S期DNA含量減少，G2/M期DNA含量明顯增加。說(shuō)明輻射后HepG2/IER5細(xì)胞周期被阻滯于G2/M期。
　　 5 IER5過表達(dá)能促進(jìn)γ-射線及順鉑誘導(dǎo)的HepG2細(xì)胞凋亡(見Fig5、6):γ-射線照射或順鉑干預(yù)后，與HepG2/Ve

11、ctor細(xì)胞相比，HepG2/IER5細(xì)胞凋亡蛋白cleaved Caspase-3及cleavage PARP表達(dá)增強(qiáng)，說(shuō)明增加IER5表達(dá)能促進(jìn)輻射及順鉑誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞凋亡。
　　 6 IER5通過增加輻射對(duì)Akt磷酸化活性的抑制作用、增加p21表達(dá)，促進(jìn)輻射誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞凋亡（見Fig5）：γ-射線照射后，與HepG2/Vector細(xì)胞相比，HepG2/IER5細(xì)胞磷酸化Akt的表達(dá)減弱，p21表達(dá)增強(qiáng)，說(shuō)明增加I

12、ER5表達(dá)能抑制Akt磷酸化活性、激活p21。
　　 結(jié)論：
　　 1 建立IER5過表達(dá)細(xì)胞系(HepG2/IER5)及對(duì)照組細(xì)胞系(HepG2/Vector)。
　　 2 增加IER5表達(dá)能抑制HepG2細(xì)胞增殖，降低HepG2細(xì)胞存活率，增強(qiáng)輻射對(duì)HepG2細(xì)胞增殖、存活、細(xì)胞分裂的抑制作用。
　　 3 增加IER5表達(dá)能增強(qiáng)輻射及順鉑誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞凋亡。IER5可通過抑制Akt磷酸化活性，激活