岷江百合抗逆相關(guān)基因的克隆及表達(dá)分析.pdf

1、岷江百合(Lilium regale Wilson)為百合科(Liliaceae)百合屬(LiliumL)植物，原產(chǎn)于中國四川岷江流域，因其具有較強(qiáng)的耐鹽堿、低溫和抗病毒的能力而作為重要的育種材料。本研究以岷江百合為試驗(yàn)材料，在已經(jīng)構(gòu)建的岷江百合cDNA文庫的基礎(chǔ)上篩選克隆與非生物脅迫相關(guān)的功能基因，并且研究它們在非生物脅迫下的表達(dá)模式，為有效挖掘和利用岷江百合的抗性優(yōu)良基因提供參考。試驗(yàn)采用cDNA文庫和RACE技術(shù)，在本實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)克

2、隆了岷江百合蛋白激酶基因lilyABC1的基礎(chǔ)上，從岷江百合成熟的葉片中克隆獲得百合調(diào)節(jié)蛋白1ily14-3-3基因和轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白lilyWBC-ABC基因的全長，并做了生物信息學(xué)的分析。結(jié)合實(shí)時熒光定量(qRT-PCR)的方法研究了以上三個基因在高鹽、低溫、高溫、黑暗、模擬干旱5種非生物脅迫下的表達(dá)模式，本研究獲得的主要結(jié)果如下:
　　1.lilyABC1基因?qū)Ω啕}、低溫、高溫、黑暗脅迫均有響應(yīng)，但表達(dá)模式卻有所不同:在高鹽、低溫脅

3、迫1h即達(dá)到表達(dá)最高峰隨后略有下降;黑暗處理也在1h時達(dá)到表達(dá)高峰，但3h以后的表達(dá)量持續(xù)降低，12h時已顯著低于對照:高溫處理6h達(dá)到表達(dá)最高峰，而后逐漸降低，lilyABC1基因不受干旱脅迫的誘導(dǎo)表達(dá)。該基因?qū)Ω鞣N非生物脅迫的敏感性也不相同，對5種非生物脅迫的敏感性次序?yàn)?低溫＞黑暗＞高溫＞高鹽＞干旱。
　　2.獲得了調(diào)節(jié)蛋白lily14-3-3基岡的全長為1111bp的cDNA序列，生物信息學(xué)分析結(jié)果顯示，該基因編碼264個

4、氨基酸，蛋白質(zhì)分子量29.57 KD，等電點(diǎn)4.77，同源性比較顯示，該基因與擬南芥GRF3有較高的序列相似性。實(shí)時熒光定量結(jié)果表明，lily14-3-3基因?qū)Ω啕}、低溫、高溫、干旱脅迫也有響應(yīng)，但是表達(dá)模式不完全相同:在高鹽和低溫脅迫下，lily14-3-3基因的表達(dá)量呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，而在黑暗和干旱條件下，隨著時間的處理卻呈現(xiàn)出逐漸下降然后略有回升的趨勢。此外，lily14-3-3基因?qū)Σ煌巧锩{迫的應(yīng)答速度也不同:在高溫條

5、件下，lily14-3-3基因在處理后1h的表達(dá)量就與對照達(dá)到了顯著的差異，而在高鹽、低溫和干旱條件下均在6h才與對照的差異開始達(dá)到顯著的水平。
　　3.lilyWBC-ABC基因cDNA全長為2000bp，生物信息學(xué)分析結(jié)果顯示，該基因編碼557個氨基酸，蛋白質(zhì)分子量62.48KD，等電點(diǎn)9.31，結(jié)構(gòu)預(yù)測顯示，該蛋白由位于膜內(nèi)和膜外的兩部分組成，在1-185位氨基酸之間含有一個AAA結(jié)構(gòu)域，屬于ATPase的結(jié)合部位。實(shí)時定量

6、qRT-PCR結(jié)果表明，lilyWBC-ABC基因在高溫、黑暗和模擬干旱條件下，表達(dá)量先升高后降低，分別在處理12小時、3小時和12小時時達(dá)到表達(dá)高峰;在NaCl處理?xiàng)l件下，除了12小時時略有下降外，lilyWBC-ABC基因的表達(dá)量總體呈現(xiàn)出上升的趨勢;低溫處理對該基因的表達(dá)量影響最小，處理不同時間均未與對照產(chǎn)生顯著的差異。
　　總之，lilyABC1基因、lily14-3-3基因和lilyWBC-ABC基因雖然在不同非生物脅迫