河北省HFRS疫區(qū)鼠攜帶漢坦病毒與人感染漢坦病毒的基因特征對應(yīng)性研究.pdf

1、目的：對河北省腎綜合征出血熱（HFRS）疫區(qū)人感染和鼠攜帶漢坦病毒（HV）進(jìn)行基因序列測定，通過DNASTAR軟件對兩者進(jìn)行比較分析，闡明同一地區(qū)鼠攜帶HV與人感染HV二者的病原學(xué)特征及聯(lián)系，為HFRS的防控提供科學(xué)依據(jù)。
　　 方法：
　　 1.通過流行病學(xué)調(diào)查，收集病人或疑似病人急性期血清標(biāo)本；并在相同區(qū)域開展夾夜法捕鼠，無菌取鼠肺；
　　 2.采用間接免疫熒光法（IFA）篩選陽性血清標(biāo)本，從中提取HV RN

2、A；用冷凍切片機(jī)切鼠肺，冷丙酮固定后，IFA篩選HV陽性鼠肺；
　　 3.通過反轉(zhuǎn)錄套式聚合酶鏈反應(yīng)（RT-nested PCR）擴(kuò)增病毒核酸，進(jìn)行基因分型；從陽性鼠肺中提取HV RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，根據(jù)已知HV標(biāo)準(zhǔn)毒株的基因序列設(shè)計SEO型和HTN型型特異性引物，用RT-nested PCR擴(kuò)增，進(jìn)行基因分型；
　　 4.選擇代表性疫區(qū)血清標(biāo)本以及相同地區(qū)鼠肺標(biāo)本PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)純化回收后進(jìn)行序列測定；

3、　　 5.利用DNASTAR軟件對人感染的HV及鼠攜帶的HV進(jìn)行同源比較并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)生樹，并對同一地區(qū)人感染的HV及鼠攜帶的HV進(jìn)行比較。
　　 結(jié)果：
　　 1.本實驗共收集病人或疑似病人血清標(biāo)本158份，經(jīng)IFA檢測陽性101份，陽性率為63.92％。對陽性血清標(biāo)本進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，得到17份陽性結(jié)果，陽性率為16.83％。
　　 2.對河北省HV陽性病人血清標(biāo)本同時用SEO型和HTN型分型引物進(jìn)行RT

4、-nested PCR擴(kuò)增，顯示陽性標(biāo)本所攜帶HV均為SEO型，未發(fā)現(xiàn)HTN型。
　　 3.本實驗從1630份鼠肺中共獲得陽性鼠肺43份，帶毒率為2.64％。從全省各地鼠密度和帶毒率分布情況看，我省HFRS疫源地帶毒鼠主要以宅區(qū)褐家鼠為主，其次為宅區(qū)小家鼠，野外帶毒鼠不是主要傳染源。
　　 4.對陽性鼠肺標(biāo)本總RNA同時用G1片段SEO型和HTN型分型引物分別進(jìn)行擴(kuò)增，顯示陽性標(biāo)本所攜帶HV均為SEO型，未發(fā)現(xiàn)HTN型。

5、
　　 5.人感染HV與鼠攜帶HV的G1、G2片段基因變異分析
　　 5.1人感染HV與鼠攜帶HV的G1片段核苷酸同源性比較及基因變異情況
　　 全省各地整體的人感染HV與鼠攜帶HV的G1片段核苷酸同源性比較結(jié)果顯示G1片段核苷酸序列同源性高達(dá)95.0％～99.7％。其中SJZ和ffTS為95.0％，CD2、BD1、BD2、BD3和ffSJZ，QHD2、TS和ffQHD，CZ1、CZ2和ffCZ都是99.7％，其

6、余的為95.2％～99.4％之間。同一地區(qū)兩種標(biāo)本的分別為：保定為95.5％～96.4％，承德95.5％～96.6％，滄州為99.7％，秦皇島為95.8％～99.7％，石家莊為95.2％，唐山為99.4％。其中核苷酸同源性最高的為滄州的CZ1和ffCZ，秦皇島的QHD2和ffQHD都是99.7％，核苷酸同源性最低為保定的BD1和ffBD1以及承德的CD1和ffCD1，各為95.5％。提示無論是同一地區(qū)的鼠和人之間，還是不同地區(qū)的鼠和人之

7、間，HV都是具有較高的同源性。
　　 5.2人感染HV與鼠攜帶HV的G2片段核苷酸同源性比較及基因變異情況
　　 從9份人血清和7份鼠肺中提取得標(biāo)本兩者之間G2片段核苷酸同源性高達(dá)92.7％～99.7％。其中CZ2和ffBD1之間的同源性為92.7％，CD2和ffCZ，BD3、BD1和ffSJZ，QHD和ffTS都分別為99.7％，其余的都在93.7％～99.3％之間。同一地區(qū)兩種標(biāo)本的分別為：保定為95.7％～98.7

8、％，承德為98.7％～99.3％，滄州為97.3％～98.3％，石家莊為94.7％，唐山為99.3％。其中核苷酸同源性最高的為承德的CD2和ffCD1以及唐山的TS和ffTS都是99.3％，核苷酸同源性最低石家莊的SJZ和ffSJZ為94.7％。
　　 6.根據(jù)G1（217-573nt）和G2（2002-2301nt）片段用DNASTAR軟件包構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。G1片段構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹顯示QHD、ffQHD、TS、ffTS株親緣關(guān)

9、系接近。ffBD1，SJZ株親緣關(guān)系接近， CZ1，ffCZ株親緣關(guān)系較近。G2片段構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹顯示ffSJZ，BD1，BD3株親緣關(guān)系接近， QHD2、TS、ffTS株親緣關(guān)系接近，SJZ，ffBD1株親緣關(guān)系接近，這與G1片斷的比較一致，說明兩地的同源性比較接近。其他序列同源性相對遠(yuǎn)些。
　　 7.基因分型及系統(tǒng)進(jìn)化樹分析表明，河北省是典型的SEO型疫區(qū)。其基因亞型根據(jù)G1、G2片段分為S1、S3二個亞型，分型結(jié)果一致，

10、均以S3亞型為主，未發(fā)現(xiàn)新亞型。除承德一小家鼠所攜帶HV根據(jù)G1片段構(gòu)建進(jìn)化樹分型為S4亞型， G1和G2片段的分型結(jié)果基本一致。
　　 結(jié)論：
　　 1.無論是同一區(qū)域，還是不同地區(qū)，河北省人感染HV與鼠攜帶HV高度同源，褐家鼠攜帶的HV是HFRS病人感染的最主要來源。
　　 2.河北省人感染HV以SEO型為主，共包括S1、S3兩個亞型，以S3亞型為主。疫源地宿主動物所攜帶的HV基因型以SEO型為主，基因亞型以