河北省漢坦病毒的分離及其代表毒株S片段全基因序列分析.pdf

1、目的：以河北省腎綜合征出血熱疫區(qū)漢坦病毒抗原陽(yáng)性的鼠肺標(biāo)本為研究對(duì)象，分離漢坦病毒，進(jìn)行型別鑒定，對(duì)所分離病毒全S基因片段核苷酸序列進(jìn)行分析，闡明河北省疫區(qū)漢坦病毒型別和基因特征，指導(dǎo)本病診斷、預(yù)防和控制。 方法： 1 IFA法對(duì)鼠肺標(biāo)本進(jìn)行初篩，免疫熒光陽(yáng)性者采取細(xì)胞培養(yǎng)的方法分離病毒。 2 復(fù)蘇既往保存的病毒毒株。 3 提取病毒RNA后采用反轉(zhuǎn)錄套式PCR進(jìn)行基因分型。 4 Rr-PCR

2、．法擴(kuò)增全S基因片段，產(chǎn)物純化后經(jīng)TA克隆連接入pMD19-T質(zhì)粒載體，轉(zhuǎn)化入JM109感受態(tài)細(xì)菌。 5 篩選陽(yáng)性重組質(zhì)粒，提取后測(cè)序，用分子進(jìn)化方法和軟件分析病毒核苷酸和氨基酸的同源性，并繪制系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。 結(jié)果： 1 4份陽(yáng)性鼠肺標(biāo)本的組織懸液接種Vero-E6細(xì)胞3～4代后，經(jīng)IFA檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)病毒特異性熒光顆粒，未發(fā)現(xiàn)致細(xì)胞病變效應(yīng)(CPE)。 2 4份標(biāo)本全部分離成功，得到4株漢坦病毒分別

3、命名為06HBB34、06HBB38、06tHBC78和06HBC79。 3 取既往保存毒株純化病毒上清或-70℃保存的毒液上清接種Vero-E6細(xì)胞1～2代后，經(jīng)IFA檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)較強(qiáng)的病毒特異性熒光顆粒，6株毒株全部復(fù)蘇成功。 4 將1O株病毒應(yīng)用特異分型引物進(jìn)行基因分型，顯示lO株病毒均屬于SEO型漢坦病毒。 5 成功構(gòu)建了含93HBX12病毒毒株全S基因片段的重組質(zhì)粒。核苷酸測(cè)序結(jié)果為：S基因片段

4、全長(zhǎng)1772 nt，其中A、T、C、G的比例分別為31.72％、23.02％、25.96％、19.30％。A+T的含量為57.67％，C+G的含量為42.33％。由5’非編碼區(qū)、開(kāi)放閱讀框以及3’非編碼區(qū)三部分組成。5’和3’非編碼區(qū)的長(zhǎng)度分別為42nt、440nt。只存在一個(gè)全長(zhǎng)為1290nt的完整開(kāi)放閱讀框，編碼N蛋白429個(gè)氨基酸。與其他漢坦病毒一樣，93HBXl2株S片段的RNA其3’和5’末端反向互補(bǔ)，形成鍋柄狀二級(jí)結(jié)構(gòu)。

5、 6 將93HBX12病毒株與其他漢坦病毒株的S基因片段核苷酸序列進(jìn)行比較，顯示93HBXl2株S基因片段核苷酸序列與SEO型的同源性最高(96.3％～97.8％)，其次是HTN型(73.4％～74.5％)和DOB型(73.7％)；氨基酸同源性與SEO型為97.9％～99.3％，與HTN型為71.8％～82.8％，與DOB型為80.4％；與PUU型和南北美洲的致HPS病毒(TULA、SN、PH、BAY、BCC、ORN、AND)相比

6、無(wú)論是核苷酸序列還是氨基酸序列同源性均相差甚遠(yuǎn)。 7 漢坦病毒全S基因片段核苷酸序列系統(tǒng)發(fā)生樹(shù)顯示，漢坦病毒主要形成分別同鼠亞科、田鼠亞科、棉鼠亞科嚙齒類宿主動(dòng)物相關(guān)的三大分支。93HBX12病毒株的位置在以鼠亞科的褐家鼠為主要宿主動(dòng)物的SEO型HV位置，與所有的毒株中親緣關(guān)系較近的是BiHDOl、ZT71和80-39株。S片段編碼區(qū)推導(dǎo)的氨基酸序列系統(tǒng)發(fā)生樹(shù)顯示，93HBX12病毒株編碼核蛋白的氨基酸序列仍與SEO型HV親緣

7、關(guān)系最相近。 結(jié)論： 1 河北省HV以SEO型為主，并在全省廣泛分布。 2 SEO型漢坦病毒分離雖無(wú)明顯細(xì)胞病變，但只要方法得當(dāng)，提高SEO型漢坦病毒的分離率是能夠?qū)崿F(xiàn)的。 3 只要保存得當(dāng)，漢坦病毒毒株可在．70℃保存十幾年以上。 4 在中國(guó)，東方田鼠可以作為SEO型漢坦病毒的一個(gè)選擇性宿主，尚未發(fā)現(xiàn)它可攜帶}[PS型漢坦病毒。 5 93HBX12病毒株S基因片段核苷酸序列與S