雞白細(xì)胞介素18成熟蛋白基因克隆與表達(dá)的研究.pdf

1、該研究根據(jù)已發(fā)表的ChIL-18成熟蛋白(mature ChIL-18,mChIL-18)的cDNA基因序列,設(shè)計一對特異性引物,應(yīng)用反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)從脂多糖(LPS)刺激10小時活化的馬立克氏病成淋巴細(xì)胞樣細(xì)胞系MDCC-MSB1的cDNA中擴(kuò)增出編碼雞IL-18成熟活性蛋白的全長基因,對擴(kuò)增片段進(jìn)行T-A克隆,經(jīng)PCR、酶切鑒定及測序驗證,成功獲得ChIL-18成熟蛋白完整基因的克隆.序列分析表明,所克隆到的ChIL-18

2、成熟蛋白編碼基因包括終止密碼子在內(nèi)全長為510bp,含有一個開放閱讀框架,這與Schneider等(2000)報道的結(jié)果完全一致.雞與人和其他11種動物的IL-18成熟蛋白基因序列分析表明,IL-18成熟蛋白基因存在種的多樣性,親緣關(guān)系越近,同源性越高.在克隆到編碼ChIL-1 8成熟蛋白的基因后,將此基因亞克隆至原核表達(dá)載體pGEX-6P-1中,構(gòu)建重組質(zhì)粒并進(jìn)行確證性序列測定.然后將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21(DE3)株中并用I

3、PTG于37℃誘導(dǎo)培養(yǎng)獲得表達(dá),表達(dá)形式為包涵體.經(jīng)過優(yōu)化選擇確定了重組ChIL-18(Recombinant ChIL-18,rChIL-18)蛋白高效表達(dá)的最適參數(shù),即當(dāng)IPTG濃度為0.2 mmol/L,誘導(dǎo)時間為4h時,表達(dá)水平最高,凝膠薄層灰度掃描顯示表達(dá)的融合蛋白約占菌體蛋白的32％.誘導(dǎo)菌體裂解物經(jīng)SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)后,用兔抗GST抗體進(jìn)行Western-blotting試驗,結(jié)果確證了GST-

4、mChIL18融合蛋白的表達(dá),表達(dá)的雞IL-18融合蛋白分子量約為44kDa,并對其進(jìn)行了親和純化.將表達(dá)產(chǎn)物從凝膠中回收,免疫4周齡小白鼠,三次免疫后,采血分離血清.用所得抗血清對SDS-PAGE后的誘導(dǎo)菌體裂解物進(jìn)行Western blot檢測,結(jié)果表明制備的多克隆抗體與ChIL-18具有良好的反應(yīng)性.將ChIL-1 8成熟蛋白基因的完整ORF進(jìn)一步克隆入真核表達(dá)載體pcDNA3.1/V5-His-TOPO中,重組質(zhì)粒pcDNA3.

5、1TOPO-mChIL18在脂質(zhì)體作用下轉(zhuǎn)染雞胚成纖維細(xì)胞(chicken embryonic fibroblast,CEF),在轉(zhuǎn)染后24、48、72小時,用pGEX-mChIL18原核表達(dá)產(chǎn)物制備的抗血清對pcDNA3.1TOPO-mChIL18轉(zhuǎn)染的CEF進(jìn)行間接免疫熒光試驗檢測,結(jié)果檢測到了mChIL-18在CEF中的表達(dá),該試驗也使mChIL-18基因在原核和真核系統(tǒng)中的表達(dá)得到了相互驗證.所有以上實驗結(jié)果為下一階段ChIL-