雞白細胞介素18成熟蛋白在昆蟲桿狀病毒系統(tǒng)中的表達及其活性檢測.pdf

1、白細胞介素18（Interleukine-18，IL-18）是1995年由Okmura等從小鼠肝臟中克隆獲得的一種細胞因子，主要由單核巨噬細胞系統(tǒng)的細胞分泌，具有強烈的IFN-γ誘生能力，對機體起著重要的免疫調節(jié)和保護作用，在抗微生物感染、抗腫瘤免疫中具有應用潛力。對人和哺乳動物IL-18的研究已有許多報道，而雞IL-18（ChIL-18）基因發(fā)現得比較晚，由于它具有與人和哺乳動物相似的生物學功能，因此ChIL-18在比較免疫學研究和禽

2、病治療中具有重要意義。
　　 本實驗室從2001年開始進行雞白細胞介素18的研究，已經在原核系統(tǒng)中實現了雞白細胞介素18成熟蛋白（mChIL-18）基因的高效表達，但由于該系統(tǒng)表達的蛋白存在非糖基化形式等缺陷，使得表達的蛋白分子常失去天然結構，因而對表達的重組蛋白的活性還存在爭議。
　　 本試驗利用昆蟲/桿狀病毒系統(tǒng)表達雞白細胞介素18成熟蛋白，進而對該重組蛋白有效地進行了生物學活性檢測。參考已發(fā)表的mChIL-18的c

3、DNA基因序列，設計一對特異性引物，以pMD18-T-mChIL-18質粒為模板，擴增出編碼mChIL-18成熟蛋白基因的cDNA片段。再以桿狀病毒pFastBacTMHTb為載體，將mChIL-18基因插入到表達載體pFastBacTMHTb的多角體蛋白啟動子PPH的下游，構建重組轉移載體質粒pFastBacTMHTb-mChIL-18，然后將已構建好的重組轉移載體質粒轉座入大腸桿菌DH10BacTM感受態(tài)細胞中，經過三次藍白斑篩選純

4、化后提取質粒，通過一對通用引物M13（Bacmid含有該引物Forward和Reverse兩個引物位點，能夠從兩側擴增LacZα互補區(qū)域內的mini-attTn7位點，有利于PCR分析）進行PCR擴增鑒定，得到重組Bacmid（Bacmid-mCMIL18）。在轉染試劑Cellfectin的作用下，通過脂質體介導法將純化的Bacmid-mChIL-18轉染至草地貪夜蛾細胞（Spodoptera frugiperda9，sf9）獲得P1代

5、重組桿狀病毒，用P1代病毒反復感染sf9來擴增病毒滴度，將達到一定滴度（107～108pfu/mL）的重組桿狀病毒再感染sf9，并在感染后不同時間段收獲sf9細胞及培養(yǎng)上清，然后對細胞進行超聲波破碎，離心后分別取裂解上清和沉淀，經SDS-PAGE電泳分析、Western blotting和間接免疫熒光（IFA）檢測，結果表明，mChIL-18基因在昆蟲細胞sf9中獲得了表達，表達的目的條帶分子量約為23KD。
　　 采用雞脾淋巴

6、細胞增殖試驗（MTT法）、IFN-γ誘導實驗和水皰性口炎病毒（VSV）抑制試驗對表達的蛋白進行生物學活性測定。
　　 雞脾淋巴細胞增殖試驗表明，mChIL-18融合蛋白能夠明顯促進淋巴細胞的增殖，不同濃度的蛋白均可刺激淋巴細胞轉化。當濃度為200ng/mL時，刺激轉化效果最佳，但隨著蛋白濃度的增大，淋巴細胞的增殖指數則會降低：VSV病毒活性抑制試驗表明，當蛋白濃度大于100ng/mL時能刺激脾淋巴細胞產生IFN-γ，并且隨著mC