羊朊蛋白基因的克隆及其原核表達.pdf

1、分別從3只藏綿羊和3只山羊全血中提取基因組總DNA,用所設(shè)計引物以聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR)擴增出細胞型朊蛋白(PrP<'C>)基因,并克隆到載體.序列分析表明所克隆的各羊PrP<'C>基因片段大小為771 bp,包含有羊朊蛋白(PrP)基因的完整編碼區(qū)序列,為含單一外顯子的完整開放閱讀框,其與國內(nèi)外報道的已知序列基本相同.本次所報道的PrP基因含5個短而富含G-C的元件,可編碼八肽或九肽.這些PrP基因與參考PrP基因相比較,其核苷酸序

2、列和推導氨基酸序列同源性分別在99.0~99.9﹪和97.7~99.6﹪之間.共發(fā)現(xiàn)16個堿基替換,其中7個為同義碼替換、9個為異義突變.異義突變中,除SY01~SY03的S240P外,其余均位于PrP氨基酸91~233的C-端結(jié)構(gòu)區(qū)域,分別為MY01的M112T和G129S突變、MY02的T191R突變、MY03的G127S突變及SY02的H143R和R211G.山羊的S240P突變似乎具有品種特異性.將再次PCR擴增的綿羊(Ov)P

3、rP基因目的DNA片段和載體pGEX-4T-1經(jīng)EcoRI和XholI酶切后連接,轉(zhuǎn)化宿主菌E.coli BL21(DE3).挑選單個菌落,提取重組質(zhì)粒,經(jīng)酶切、PCR擴增后瓊脂糖凝膠電泳分析和測序鑒定,成功地構(gòu)建了2種綿羊重組朊蛋白(Ov rPrP)的表達質(zhì)粒pMY01[OvrPrP(23~244)]和pMY02[Ov rPrP(91~244)].重組陽性菌用IPTG誘導表達,收集不同培養(yǎng)時間的菌液進行SDS-PAGE和Western