人朊蛋白基因的克隆表達及抗血清的制備.pdf

1、以人外周血液提取的總DNA為模板，PCR擴增人朊蛋白編碼基因(PRNP)的ORF，克隆至pMD18T載體，構建重組質粒HoPRNP-T，用DNAstar軟件與GenBank上發(fā)表的序列M13899進行同源性分析，結果發(fā)現核苷酸序列同源性為99.6﹪，氨基酸序列同源性99.8﹪。以HoPRNP-T質粒為模板，擴增出編碼人成熟朊蛋白(matureprionprotein，mPrP)的基因片斷，與pET30a(+)表達載體連接，構建出表達人m

2、PrP的重組質粒pET-homPrP。經酶切鑒定后電轉化pET-homPrP至宿主菌EcoliBL21(DE3)中，IPTG誘導表達，SDS-PAGE顯示表達產物為分子量為約30ku的融合蛋白。超聲波裂解重組菌體后用Ni-NTA親和層析法純化融合蛋白，以SDS-PAGE檢測純化的表達產物，表明親和層析法純化的融合蛋白純度可達到90﹪。再以SAF70進口單抗為檢測抗體，Western-blotting顯示融合蛋白具有良好的反應原性。以純化

3、的融合mPrP作為免疫原，以含有pET30a(+)空載體的E.coliBL21(DE3)的菌體蛋白作為對照免疫原，分別與弗氏完全佐劑1∶1混合乳化，按100μg/只劑量皮下分3點注射8周齡清潔級BALB/c雌性小鼠，在第3周和第5周以同法、同劑量弗氏不完全佐劑乳化的兩種免疫原分別進行加強免疫，第3次免疫3天后摘眼球取血，用間接ELISA法檢測抗血清的效價。結果表明抗人mPrP的血清效價為1∶512；Western-blotting比較分