馬鈴薯S病毒外殼蛋白的原核表達及其抗血清的制備.pdf

1、本研究的目的是構建馬鈴薯S病毒外殼蛋白基因的原核表達載體，使其在大腸桿菌中高效表達，用表達的融合蛋白作為抗原制備抗血清，為進一步制備馬鈴薯S病毒的ELISA檢測試劑盒打基礎?！　∮肞VS-cp基因的上、下游引物及pGEM-pvs模板進行PCR擴增，瓊脂糖凝膠電泳顯示擴增產(chǎn)物為一條分子量約為890bp的特異條帶。用Ultrafree-DA試劑盒一步離心法回收890bp的特異擴增片段，然后與T表達載體pBAD/Thio連接，重組質粒轉化受

2、體菌TOP10。經(jīng)氨芐青霉素抗性篩選、質粒電泳檢測、PCR擴增及SphI與PstI限制性內(nèi)切酶的單酶切和雙酶切鑒定，篩選到了陽性克隆，相應的重組質粒被命名為pBAD-pvs。單獨使用基因的引物或混合使用基因及載體的引物進行PCR檢測，獲得了目的基因正向插入表達載體的目的克隆，對應的重組質粒命名為pBAD-pvs+?！　≈亟M質粒pBAD-pvs+中外源基因是受阿拉伯糖啟動子控制表達的。在42℃，TOP10(pBAD-pvs+)用2％阿拉

3、伯糖誘導培養(yǎng)4小時后，SDS-PAGE凝膠電泳顯示表達產(chǎn)物中有一條分子量為46KDa的特異性蛋白條帶，其大小與預期的融合蛋白相符，該蛋白在總蛋白中的含量為20.22％。在硝酸纖維素膜上進行Westernblotting分析，結果顯示該融合蛋白與PVS-IgG有反應，形成明顯的雜交帶，表明該融合蛋白是PVS-cp嵌合基因正確表達的產(chǎn)物?！　∮萌芫钙扑榫w，提取總蛋白，SDS-PAGE顯示表達的融合蛋白主要以包涵體的形式存在。經(jīng)4M尿素

4、洗滌后的包涵體蛋白，用超純水4℃過夜溶解，SDS-PAGE顯示得到了只含有該融合蛋白的水溶液，即建立了純化該融合蛋白比較簡便的方法。經(jīng)洗滌后的包涵體蛋白用6M尿素溶解，在氧化型和還原型谷胱甘肽存在的條件下復性，電泳顯示得到了該融合蛋白純度較高的水溶液。兩種途徑獲得的蛋白溶液經(jīng)濃縮透析后作為制備抗血清的抗原。　　除采用上述兩種蛋白溶液外，含目的蛋白的SDS-PAGE膠條經(jīng)液氮研磨后的粉末也作為抗原。三種抗原同時免疫家兔，制備出了三種抗血