RNA干擾在對(duì)蝦抗病毒免疫中的作用.pdf

1、對(duì)蝦白斑綜合癥病毒(White Spot Syndromic Virus，WSSV)，是一種嚴(yán)重危害對(duì)蝦養(yǎng)殖業(yè)的主要病原，目前還未找到有效的防治方法。
　　 小干擾RNA(siRNA)介導(dǎo)的RNA干擾是真核生物抵抗RNA病毒侵染的一種免疫機(jī)制，但動(dòng)物是否可以利用siRNA途徑來抵抗DNA病毒的侵染，迄今還未見到相關(guān)報(bào)道。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)感染有雙鏈DNA病毒(WSSV)的日本對(duì)蝦可以產(chǎn)生具有抗病毒作用的siRNA(vp28-s

2、iRNA)。這一siRNA與WSSV的感染有著密切的聯(lián)系，它的產(chǎn)生和作用依賴于宿主的Dicer2和Ago2蛋白。利用熒光原位雜交技術(shù)，我們發(fā)現(xiàn)在vp28-siRNA存在于病毒感染48 h后的血淋巴細(xì)胞胞漿中。Dicer2的表達(dá)沉默導(dǎo)致了vp28-siRNA的表達(dá)缺失和病毒復(fù)制的加快。鎖核酸(LNA)修飾的反義核酸可以有效抑制vp28-siRNA的作用，導(dǎo)致病毒基因組拷貝數(shù)在病毒感染24-48 h后顯著上升。本研究首次表明了動(dòng)物可以利用s

3、iRNA途徑來抵抗DNA病毒的侵染。
　　 MicroRNA(miRNA)是在轉(zhuǎn)錄后水平上調(diào)節(jié)基因表達(dá)的一種的非編碼小RNA，參與真核生物很多細(xì)胞過程。有報(bào)道表明病毒的侵染可以導(dǎo)致宿主miRNA的表達(dá)發(fā)生變化，但目前，對(duì)病毒感染相關(guān)海洋無脊椎動(dòng)物miRNA的研究還未見報(bào)道。本論文以日本對(duì)蝦（Marsupenaeus japonicus）作為試驗(yàn)材料，對(duì)WSSV感染不同時(shí)間段（0、6、24和48 h）的對(duì)蝦淋巴器官中的小RNA進(jìn)行

4、高通量測序。我們共鑒定了63條對(duì)蝦miRNA，包括48條保守的miRNA（可歸為43個(gè)家族）和15條對(duì)蝦物種所特異的miRNA。其中，有31條miRNA在病毒感染后發(fā)生了顯著的差異表達(dá)，包括上調(diào)表達(dá)的25條和下調(diào)表達(dá)的6條。利用TargetScan和miRanda軟件，我們對(duì)差異表達(dá)的miRNA進(jìn)行靶基因預(yù)測，并發(fā)現(xiàn)大多數(shù)靶基因與宿主的免疫反應(yīng)有關(guān)。GO分析結(jié)果表明，這些差異表達(dá)的miRNA參與各種免疫信號(hào)途徑。通過進(jìn)化分析，我們發(fā)現(xiàn)m

5、iR-1、miR-7和miR-34在對(duì)蝦、果蠅和人類中序列高度保守并參與相似的途徑。本研究首次對(duì)病毒感染相關(guān)的海洋無脊椎動(dòng)物miRNA進(jìn)行高通量測序和鑒定，揭示了miRNA在介導(dǎo)宿主和病毒間相互作用的分子機(jī)制。
　　 越來越多的哺乳動(dòng)物細(xì)胞研究表明宿主miRNA在宿主抗病毒免疫中發(fā)揮著重要的作用，而有關(guān)無脊椎動(dòng)物miRNA的抗病毒作用的研究目前還非常少。根據(jù)前面的結(jié)果，我們發(fā)現(xiàn)對(duì)蝦miR-7在WSSV感染過程中發(fā)生了顯著上調(diào)表達(dá)

6、，并可以靶向WSSV早期基因wsv477的3'非編碼區(qū)(3'UTR)，意味著宿主miR-7很可能參與病毒的DNA復(fù)制過程。在昆蟲High Five細(xì)胞中，我們驗(yàn)證了體外合成的miR-7模擬物可以顯著降低攜帶有wsv4773'UTR的熒光質(zhì)粒的表達(dá)。當(dāng)miR-7模擬物的作用被鎖核酸修飾的anti-miR-7(AMO-miR-7)抑制后，熒光質(zhì)粒的表達(dá)又恢復(fù)到正常水平。體內(nèi)試驗(yàn)結(jié)果表明，miR-7的過表達(dá)可以導(dǎo)致WSSV基因組拷貝數(shù)在病毒感

7、染72 h和96h后下降到對(duì)照組(只注射WSSV)的1/1000。相反地，AMO-miR-7抑制內(nèi)源性miR-7后，WSSV基因組拷貝數(shù)較對(duì)照組上升了一個(gè)數(shù)量級(jí)。研究還發(fā)現(xiàn)，miR-7的產(chǎn)生依賴于Dicer1蛋白。因此，本研究揭示了無脊椎動(dòng)物miRNA及其病毒靶基因在宿主和病毒間存在著相互作用。
　　 近年來越來越多的研究發(fā)現(xiàn)，動(dòng)物DNA病毒在侵染宿主過程中也可以編碼自身的miRNA。然而，有關(guān)病毒miRNA的作用機(jī)制目前還不是

8、很清楚，尤其是無脊椎動(dòng)物DNA病毒產(chǎn)生的miRNA。本研究對(duì)WSSV感染0、6、24和48 h后的對(duì)蝦淋巴器官的小RNA文庫中進(jìn)行深入分析，共鑒定了49條WSSV編碼的miRNA。利用Vmir軟件預(yù)測和miRNA芯片雜交技術(shù)，我們從WSSV感染24和48h后的對(duì)蝦淋巴器官、血淋巴細(xì)胞和腮組織中再鑒定了151條WSSV miRNA。miRNA芯片雜交結(jié)果表明，WSSV miRNA的表達(dá)具有組織特異性和時(shí)序特異性。利用生物信息學(xué)方法，我們對(duì)

9、測序獲得的49條WSSV miRNA進(jìn)行靶基因預(yù)測和GO分析。通過進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，WSSV可以利用自身編碼的WSSV-miR-24抑制宿主血淋巴細(xì)胞的凋亡反應(yīng)。體外和體內(nèi)分析表明，WSSV-miR-24可以通過靶向宿主Caspase8基因的3'UTR抑制該基因的表達(dá)，從而降低了宿主細(xì)胞的凋亡水平和Caspase酶活，促進(jìn)了WSSV在血淋巴細(xì)胞中的存活和復(fù)制。本研究綜合了小RNA高通量測序、miRNA芯片雜交和生物信息學(xué)預(yù)測等方法，對(duì)WS

10、SV編碼的miRNA進(jìn)行深入挖掘，并首次揭示了無脊椎動(dòng)物病毒可以利用自身編碼miRNA對(duì)宿主先天性免疫系統(tǒng)進(jìn)行干預(yù)。
　　 Argonaute(Ago)蛋白是siRNA和miRNA通路中的關(guān)鍵蛋白，在宿主RNAi抗病毒免疫中發(fā)揮著重要的作用。研究發(fā)現(xiàn)許多真核生物擁有多個(gè)Ago蛋白和異構(gòu)體，而有關(guān)Ago異構(gòu)體的功能仍知之甚少。本研究發(fā)現(xiàn)日本對(duì)蝦Ago1基因產(chǎn)生三種不同轉(zhuǎn)錄本，分別是Ago1A、Ago1B和Ago1C，其中Ago1

11、A和Ago1B在PIWI結(jié)構(gòu)域中包含有一段72bp的插入序列。通過熒光定量PCR，我們發(fā)現(xiàn)Ago1A和Ago1B在對(duì)蝦淋巴器官和血淋巴細(xì)胞中有較高的表達(dá)水平并在WSSV感染后發(fā)生了顯著上調(diào)表達(dá)，說明了這兩個(gè)Ago1異構(gòu)體與對(duì)蝦抗病毒有關(guān)。研究發(fā)現(xiàn):Ago1A的表達(dá)沉默可以導(dǎo)致病毒基因組拷貝數(shù)顯著增加。當(dāng)Ago1BmRNA被特異性siRNA敲低到30-63％水平后，WSSV基因組拷貝數(shù)較對(duì)照組(只注射WSSV)發(fā)生了顯著的增加;而進(jìn)一步敲

12、低Ago1BmRNA至15％以下，WSSV拷貝數(shù)較對(duì)照組不僅沒有顯著性增加，反而促進(jìn)Ago1AmRNA的上調(diào)表達(dá)?？赡苁茿go1A的上調(diào)表達(dá)彌補(bǔ)了Ago1B在宿主抗病毒中的缺失，導(dǎo)致了Ago1B表達(dá)沉默后對(duì)病毒復(fù)制沒有明顯的影響。與單獨(dú)抑制Ago1A或Ago1B相比，同時(shí)抑制Ago1 A和Ago1B的表達(dá)導(dǎo)致了宿主對(duì)病毒的侵染產(chǎn)生更強(qiáng)的敏感性，而抑制Ago1C對(duì)病毒的復(fù)制沒有任何影響，說明了Ago1A和Ago1B在對(duì)蝦抵抗WSSV侵染中

13、發(fā)揮著關(guān)鍵作用。因此，本研究首次在無脊椎動(dòng)物中揭示了Ago異構(gòu)體的產(chǎn)生與抗病毒有關(guān)。
　　 RNaseⅢ家族成員Drosha是miRNA成熟過程中的第一個(gè)關(guān)鍵蛋白，但迄今為止對(duì)Drosha蛋白在病毒感染中的作用機(jī)制仍不清楚。本研究首次克隆了日本對(duì)蝦的Drosha基因，并通過序列分析發(fā)現(xiàn)該基因可以編碼1081個(gè)氨基酸殘基的多肽。對(duì)蝦Drosha蛋白包含了兩個(gè)RNaseⅢ結(jié)構(gòu)域和雙鏈RNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域，與其他物種的Drosha蛋白具有

14、較高的同源性。熒光定量PCR結(jié)果表明:Drosha基因在對(duì)蝦淋巴器官中具有較高的表達(dá)水平，并在WSSV刺激后發(fā)生了顯著的上調(diào)表達(dá)，說明了該蛋白與對(duì)蝦的抗病毒有關(guān)。Drosha基因的表達(dá)沉默不僅影響了miRNA的成熟，還導(dǎo)致宿主對(duì)病毒的敏感性增強(qiáng)，說明了Drosha在對(duì)蝦抵抗病毒侵染中發(fā)揮著重要的作用。
　　 RNA干擾在真核生物抵抗RNA病毒侵染中發(fā)揮著重要的作用，然而這種保守的抗病毒機(jī)制是否也是無脊椎動(dòng)物抵抗DNA病毒侵染的一