葡萄ACS基因啟動(dòng)子的克隆及活性分析.pdf

1、逆境脅迫會(huì)嚴(yán)重影響植物的生長發(fā)育，進(jìn)而導(dǎo)致作物產(chǎn)量下降及品質(zhì)降低。乙烯作為一種重要的內(nèi)源信號(hào)分子，在植物響應(yīng)逆境脅迫過程中發(fā)揮著十分重要的作用，ACC合成酶是乙烯生物合成途徑中專一催化S-腺苷甲硫氨酸合成1-氨基環(huán)丙烷-1-羧酸的關(guān)鍵限速酶，它在植物組織內(nèi)的產(chǎn)量和活性往往決定乙烯產(chǎn)生的速率，因此研究ACC合成酶基因表達(dá)調(diào)控的分子機(jī)制十分必要。本研究以歐洲葡萄葉片為材料，克隆了VvACS5和VvACS7基因啟動(dòng)子，分析了兩個(gè)基因啟動(dòng)子的順

2、式作用元件，并研究了順式作用元件對(duì)啟動(dòng)子活性的影響，具體結(jié)果如下:
　　1.利用普通PCR技術(shù)擴(kuò)增得到了VvACS5和VvACS7基因啟動(dòng)子序列，長度分別為1019bp和1103bp。利用PLACE和PlantCARE在線數(shù)據(jù)庫分析了兩個(gè)基因啟動(dòng)子中含有的順式作用元件，發(fā)現(xiàn)存在多種參與植物逆境響應(yīng)相關(guān)的順式作用元件，如ABRE、ERE、TGACG-motif、CGTCA-motif、P-box、TATC-box、MBS、TC-ri

3、ch等。
　　2.設(shè)計(jì)帶有酶切位點(diǎn)特異性引物，對(duì)VvACS5和VvACS7基因啟動(dòng)子進(jìn)行5'缺失克隆。將克隆的7條長度不等的5'缺失片段分別與pBI-221-LUC融合，構(gòu)建7個(gè)帶有長度不等的缺失片段的表達(dá)載體。
　　3.利用PEG-Ca2+介導(dǎo)法，將7個(gè)重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)染野生型擬南芥原生質(zhì)體細(xì)胞中，檢測(cè)報(bào)告基因LUC表達(dá)量，并分析啟動(dòng)子的活性。結(jié)果顯示VvACS5和VvACS7基因啟動(dòng)子均能夠驅(qū)動(dòng)下游報(bào)告基因LUC的表達(dá)，同

4、時(shí)發(fā)現(xiàn)VvACS5基因啟動(dòng)子中存在對(duì)下游基因表達(dá)起到促進(jìn)作用的兩個(gè)激活區(qū)域(-1015～-717，-717～-269);VvACS7基因的啟動(dòng)子中存在對(duì)下游基因表達(dá)起到促進(jìn)作用的一個(gè)激活區(qū)域(-364～-139)和起到抑制作用的兩個(gè)抑制區(qū)域(-848～-648，-648～-364)。
　　綜上所述，本研究克隆得到了2個(gè)VvACS基因啟動(dòng)子序列，初步確定了VvACS基因啟動(dòng)子中順式作用元件的種類和特性，構(gòu)建了7個(gè)帶有5'缺失片段的表