灰飛虱對(duì)毒死蜱和噻嗪酮的抗性機(jī)制研究.pdf

1、灰飛虱Laodelphax striatellus(Fallén)是我國(guó)糧食作物上的一種重要害蟲(chóng)，它不僅刺吸取食禾本科植物造成蟲(chóng)害，還通過(guò)傳播病毒而引起水稻、玉米、小麥等重要糧食作物的病毒病。2000年以前灰飛虱在我國(guó)只是零星發(fā)生，長(zhǎng)期作為次要害蟲(chóng)對(duì)其進(jìn)行防治。但自從2005年以來(lái)，該蟲(chóng)在我國(guó)許多地區(qū)特別是江蘇、山東等省頻繁暴發(fā)。長(zhǎng)期大面積和不合理使用化學(xué)藥劑導(dǎo)致灰飛虱抗藥性的產(chǎn)生，灰飛虱對(duì)殺蟲(chóng)劑抗藥性的產(chǎn)生是其近年來(lái)暴發(fā)頻繁的主要原因

2、之一。因此，必須加強(qiáng)灰飛虱的抗性治理，以期延緩其抗性進(jìn)一步發(fā)展。明確殺蟲(chóng)劑的抗性機(jī)制是害蟲(chóng)抗性治理的前提。本文以灰飛虱室內(nèi)抗藥性篩選為基礎(chǔ)，系統(tǒng)地研究了灰飛虱對(duì)毒死蜱和噻嗪酮的抗性生化、分子生物學(xué)機(jī)理。為更好地進(jìn)行灰飛虱抗性治理和新藥開(kāi)發(fā)提供新的依據(jù)。
　　 一、灰飛虱抗毒死蜱品系的抗性篩選及生化機(jī)理研究經(jīng)過(guò)對(duì)灰飛虱云南敏感品系(YN)連續(xù)32代的毒死蜱抗性篩選，與云南品系相比，毒死蜱抗性品系（YN-CPF）的抗藥性上升到213

3、.49倍;該抗性品系在連續(xù)12代無(wú)藥劑篩選壓力下其抗性衰退為83.08倍，以此作為抗性衰退品系（YN-DPF）。以YN，YN-DPF和YN-CPF品系為試蟲(chóng)，通過(guò)解毒代謝酶活力和增效劑生物測(cè)定分析，研究了灰飛虱對(duì)毒死蜱的抗性生化機(jī)理。分別在YN-CPF、YN-DPF和YN品系中測(cè)定了PBO、DEM和TPP對(duì)毒死蜱的增效作用。結(jié)果顯示在抗性和抗性衰退品系中，多功能氧化酶抑制劑PBO分別對(duì)毒死蜱有3.77倍和2.28倍的增效作用，谷胱甘肽S

4、-轉(zhuǎn)移酶抑制劑DEM對(duì)毒死蜱的增效作用分別為2.82倍和1.79倍，羧酸酯酶抑制劑TPP對(duì)毒死蜱的增效作用分別為4.31倍和2.59倍，三種增效劑在敏感品系中均未對(duì)毒死蜱表現(xiàn)出顯著的增效作用。解毒代謝酶活力測(cè)定結(jié)果顯示抗性品系細(xì)胞色素P450單加氧酶活力為敏感品系的0.67倍;谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶活力在兩品系間無(wú)顯著差異;酯酶活力在抗性和抗性衰退品系中分別為敏感品系中的4.15倍和1.92倍。此外，抗性品系乙酰膽堿酯酶最大反應(yīng)速率(Km)

5、是敏感品系的2.56倍，親和力及氧化毒死蜱抑制中濃度分別為敏感品系的1.81倍(Km-YN-CPF/Km-YN)和5.53倍(I50-YN-CPF/I50-YN)。以上結(jié)果說(shuō)明，酯酶活性提高以及乙酰膽堿酯酶敏感性下降可能參與了毒死蜱的抗性形成，關(guān)于細(xì)胞色素P450-單加氧酶和谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶在毒死蜱抗性中的具體作用方式還需進(jìn)一步研究。
　　 二、灰飛虱抗噻嗪酮品系的抗性篩選及生化機(jī)理研究對(duì)灰飛虱YN品系連續(xù)41代的噻嗪酮抗性篩

6、選，獲得了82.08倍的相對(duì)噻嗪酮抗性品系YN-BPF;對(duì)南京田間灰飛虱品系(NJ)連續(xù)12代的噻嗪酮抗藥性篩選，與初始NJ和YN品系相比，獲得的南京抗性品系(NJ-BPF)對(duì)噻嗪酮的相對(duì)抗性分別為4.46倍和96.58倍。以YN-BPF、NJ-BPF品系和YN品系為試蟲(chóng)，通過(guò)解毒代謝酶活力和增效劑生物測(cè)定分析，初步研究了灰飛虱對(duì)噻嗪酮抗性的生化機(jī)理。分別在YN、NJ-BPF和YN-BPF品系中測(cè)定了PBO、DEM和TPP對(duì)噻嗪酮的增效

7、作用，結(jié)果顯示，三類增效劑在YN品系中對(duì)噻嗪酮都未表現(xiàn)出顯著的增效作用。在YN-BPF和NJ-BPF品系中，PBO分別對(duì)噻嗪酮有1.77倍和1.69倍的增效作用，細(xì)胞色素P450單加氧酶活力也分別比敏感品系中升高了1.39倍和1.89倍; DEM分別對(duì)噻嗪酮有1.02倍和1.03倍的增效作用，谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶活力在噻嗪酮抗、感品系間也未表現(xiàn)出顯著差異;酯酶抑制劑TPP分別對(duì)噻嗪酮有1.50倍和1.77倍的增效作用，酯酶活力與YN品系相

8、比分別升高了1.69倍和2.16倍。此外，YN-BPF和NJ-BPF品系中乙酰膽堿酯酶酶活力分別為YN品系的1.79和1.53倍。以上研究結(jié)果表明，酯酶及細(xì)胞色素P450單加氧酶活力的提高在一定程度上參與了噻嗪酮代謝抗性的形成，而乙酰膽堿酯酶活力升高對(duì)噻嗪酮抗性的形成可能也有一定的輔助作用。
　　 三、灰飛虱羧酸酯酶基因序列及表達(dá)量分析以云南敏感品系為材料，運(yùn)用RT-PCR技術(shù)從灰飛虱轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)中成功驗(yàn)證出31條灰飛虱羧酸酯酶

9、基因（暫名為L(zhǎng)s.CarE1-31）。分別在毒死蜱抗性和敏感品系中比較了這些基因的表達(dá)差異，結(jié)果發(fā)現(xiàn):與YN品系相比，Ls.CarE1和Ls.CarE2在YN-CPF品系中分別具有32.6倍和7.52倍的顯著過(guò)量表達(dá)。以YN-DPF品系為實(shí)驗(yàn)材料，分析過(guò)量表達(dá)的羧酸酯酶基因的抗性相關(guān)性，結(jié)果顯示，Ls.CarE1和Ls.CarE2在抗性衰退品系中的表達(dá)量分別為敏感品系中的8.6倍和1.09倍。這些結(jié)果表明，過(guò)量表達(dá)的Ls.CarE1與毒

10、死蜱抗性水平密切相關(guān)，而在毒死蜱抗性品系中過(guò)量表達(dá)的Ls.CarE2與抗性水平不存在一致的相關(guān)性。此外，毒死蜱抗性和敏感品系中的羧酸酯酶氨基酸序列比較發(fā)現(xiàn)，毒死蜱抗性個(gè)體中Ls.CarE9、Ls.CarE16、Ls.CarE24和Ls.CarE25存在相對(duì)穩(wěn)定的點(diǎn)突變。由此推斷，不僅過(guò)量表達(dá)的Ls.CarE1參與了毒死蜱抗性的形成，部分羧酸酯酶點(diǎn)突變也可能是毒死蜱抗性形成的重要因子。
　　 四、灰飛虱細(xì)胞色素P450基因序列及表

11、達(dá)分析從灰飛虱轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中篩選出編碼細(xì)胞色素P450的序列112條（長(zhǎng)度從100 bp到2000 bp以上），去掉較短的及重復(fù)測(cè)序的序列，RT-PCR共驗(yàn)證出大于279 bp的灰飛虱P450基因55條，其中26條具有完整的氨基酸序列編碼區(qū)。進(jìn)一步在灰飛虱抗、感噻嗪酮和毒死蜱的品系中分析了這些基因的表達(dá)情況。與敏感品系相比，CYP6CW1在噻嗪酮抗性品系中表現(xiàn)出9.75倍的過(guò)量表達(dá)。此外，3個(gè)P450基因（CYP4C， CYP4DE1和C

12、YP6AX）在毒死蜱抗性品系中表達(dá)量與敏感品系的相比分別下降了82.01％，89.22％和92.25％。這些結(jié)果表明，過(guò)量表達(dá)的CYP6CW1可能在噻嗪酮抗性中發(fā)揮重要作用，減少的毒死蜱活化也有可能參與了毒死蜱抗性的形成。
　　 五、毒死蜱抗性相關(guān)的羧酸酯酶基因RNAi功能分析及原核表達(dá)利用cDNA末端快速擴(kuò)增技術(shù)（RACE）克隆了灰飛虱Ls.CarE1的全長(zhǎng)cDNA序列。Ls.CarE1全長(zhǎng)共1839 bp，編碼547個(gè)氨基酸

13、，5'-UTR為87bp，3'-UTR為111bp.序列分析表明LsCarE1具有羧酸酯酶的基因序列特征，包括三個(gè)催化三聯(lián)體氨基酸殘基Ser215、Glu345、 His466;氧負(fù)離子孔Gly134、Gly135、 Ala217;半胱氨酸環(huán)殘基Cys92、 Cys110等編碼序列。氨基酸序列比對(duì)表明，Ls.CarE1與已報(bào)道的褐飛虱羧酸酯酶序列(GenBank: AAG40239.1)同源性達(dá)72％。因此推斷Ls.CarE1序列為灰飛

14、虱的羧酸酯酶基因序列。接著對(duì)其RNAi分析發(fā)現(xiàn)，以兩個(gè)不同濃度（80 ng/ul和200ng/ul）的Ls.CarE1-dsRNA連續(xù)6天喂養(yǎng)灰飛虱抗毒死蜱品系的一齡若蟲(chóng)后，Ls.CarE1的表達(dá)量分別下降62.6％和68.72％。進(jìn)一步以毒死蜱(800 mg/L).對(duì)RNA干擾后的抗性品系灰飛虱進(jìn)行毒力測(cè)定，結(jié)果顯示:與對(duì)照相比，死亡率分別由33.7％上升至72.31％(80 ng/ul)和31.7％上升至69.56％(200 ng/