新城疫病毒TS09-2株全長cDNA克隆的構建及熒光定量RT-PCR檢測方法的建立.pdf

1、新城疫病毒(Newcastle Disease Virus，NDV)為副粘病毒科副粘病毒屬成員，其引起的新城疫(Newcastle Disease，ND)是一種高傳染性高破壞性的疾病，被國際獸醫(yī)局認定為兩種A類禽病之一。當前，新城疫的防控以免疫預防為主，以NDV V4耐熱株為代表的耐熱活疫苗具有耐熱、冷鏈要求低、使用方便、毒力低、免疫效果好和可同居感染等優(yōu)點，在我國及其他發(fā)展中國家有著廣闊的應用前景?，F已有的NDV耐熱毒株有V4、I-2

2、、HB92、B95和TS09等，其中TS09株是我課題組經過對V4株的雞胚耐熱選育、純化獲得的。如能夠采用反向遺傳操作技術將NDV耐熱毒株改造為耐熱載體，插入其他禽類疫病的主要免疫源性基因，研發(fā)出禽類主要疫病的多聯(多價)耐熱活疫苗，將對禽病的防控帶來深遠的影響。但是，關于NDV耐熱毒株反向遺傳操作系統(tǒng)的成功構建至今仍未見報道。因此，本研究以TS09耐熱株為研究對象，開展了NDV耐熱毒株反向遺傳操作系統(tǒng)的構建工作。
　　 一、新

3、城疫病毒耐熱株的細胞適應培養(yǎng)
　　 現有的反向遺傳操作系統(tǒng)大多是在細胞上建立的，而TS09株為雞胚適應株，不能在細胞上高效增殖。首先開展了TS09株的BHK細胞適應性培養(yǎng)及純化工作。細胞培養(yǎng)條件的優(yōu)化結果表明，0.2μg/mL的TPCK胰酶濃度為最大無毒濃度。連續(xù)17代傳代培養(yǎng)及3次極限稀釋法純化，獲得了一株新的、純化的、適應BHK細胞的NDV耐熱株，命名為TS09-C株。TS09-C株的生物學特性測定結果表明：TS09-C株的

4、EID50值由原有的108.6/mL下降至105.7/mL，但TCID50值由原有的103.3/mL上升至107.9/mL，表明TS09-C株為細胞適應毒，且保持了親本株的弱毒和耐熱的特性，成功選育了新城疫耐熱株細胞適應毒株。此外，序列分析結果表明：TS09、TS09-C和V4株仍保持著較近的遺傳進化關系。
　　 二、TS09-C株的全基因組序列測定與分析
　　 設計了10對PCR引物對TS09-C株的全基因組進行了序列

5、測定與分析。測序結果經序列拼接后獲得TS09-C全基因組序列，全長15186nt。序列分析表明TS09-C和I-2、I-2progenitor、Ulster-67共處在I型分支上，編碼6個結構蛋白(NP、P、M、F、HN和L)和兩個非結構蛋白(V和W)；通過比對TS09-C株和V4株各基因的氨基酸同源性，發(fā)現M基因的同源性最低，為92.3%；F和HN的同源性較高，均大于99%。HN蛋白糖基化位點分析表明，TS09-C株HN蛋白僅含有4個

6、糖基化位點，缺失119位和508位糖基化位點。
　　 采用生物信息學技術對TS09-C株的耐熱機理進行了初步探討。比較包括TS09-C株在內的4株耐熱株和非耐熱株氨基酸序列時，共發(fā)現23個耐熱株特有的氨基酸差異，其中大部分為保守性突變，非保守性突變僅發(fā)現在P和W蛋白上。蛋白質二級結構比較分析表明耐熱株和非耐熱株的二級結構上的差異主要在HN蛋白的α螺旋區(qū)。這些耐熱株特有位點(或結構)的發(fā)現為我們進一步研究其耐熱提供了思路。

7、　　 三、TS09-C株全長感染性cDNA克隆的構建
　　 參考已經獲得的TS09-C株全基因組序列，并進行酶切位點分析，設計出了TS09-C株全長感染性cDNA克隆的構建策略。共設計了8對引物用于全長cDNA克隆的構建。通過高保真RT-PCR，擴增出了8個片段(A、B、C、D、E、F、G1和G2)，G1和G2通過融合PCR形成G片段。在A片段的上游引入了T7 RNA聚合酶的啟動子，G片段通過融合PCR在其下游引入了T7 RN

8、A聚合酶的終止子和丁型肝炎病毒核酶序列。通過酶切連接的方法構建出三個中間質粒：pBR-ABC，pBR-DE和pBR-FG。再通過酶切連接的方法將ABC和DE插入pBR-FG中形成pBR-TS09-C全長質粒。經測序分析，與TS09-C株全基因組序列相比，全長質粒上有6處突變，其中4處同義突變，僅兩處突變引起了氨基酸的改變，分析表明：這兩處氨基酸突變在NDV其他毒株中也同樣存在，不會影響到后續(xù)病毒的拯救恢復。
　　 四、新城疫病毒

9、熒光RT-PCR檢測方法的建立與應用
　　 為給后續(xù)的新城疫研究提供快捷的定量檢測方法，本研究建立了新城疫病毒熒光定量RT-PCR檢測方法。經對部分發(fā)表在NCBI里的新城疫病毒序列進行比對，在其F基因上找到一個相對保守序列，根據保守序列設計一對引物和一條TaqMan探針。以新城疫I系疫苗株(Mukteswar株)作為標準品，通過系列條件優(yōu)化、特異性、靈敏性和重復性實驗，建立了一種靈敏度高、特異性強和重復性好的熒光RT-PCR檢測

10、新城疫病毒的方法。該方法能檢測最低初始病毒濃度為102.2ELD50/mL，且在1082-1022ELD50/mL范圍內Ct值與病毒的濃度的對數值(1gELD50/mL)呈很好的線性關系，R2達到0.9975；該方法與禽流感病毒、禽痘病毒和禽大腸桿菌等禽病病原核酸無交叉反應；批間和批內重復性良好；臨床樣品檢測中熒光RT-PCR與雞胚分毒的符合率、診斷靈敏度和診斷特異性分別為98.5%、50%和98.4%。因此，熒光RT-PCR檢測方法的