新城疫病毒ClassⅠ型毒株分子特性分析及熒光定量RT-PCR檢測(cè)方法的建立.pdf

1、新城疫是由禽副粘病毒Ⅰ型（新城疫病毒，NDV）引起的主要感染禽類的一種急性、高度接觸性、致死性傳染病，對(duì)養(yǎng)禽業(yè)危害巨大，被世界動(dòng)物衛(wèi)生組織(OIE)規(guī)定為法定報(bào)告疫病。
　　 根據(jù)新城疫病毒基因組特性可以將新城疫病毒分為兩類:Ⅰ類(ClassⅠ)和Ⅱ類(ClassⅡ)，兩類不同NDV在基因組特性和抗原性差異顯著。目前鑒定的NDV基因組長度包括15186、15192、15198nt三種。Ⅱ類新城疫病毒可分為Ⅰ～Ⅸ九個(gè)基因型，其中基

2、因Ⅶ型分離株被認(rèn)為是引起世界范圍內(nèi)新城疫第四次大流行的主要病原體。Ⅰ類新城疫病毒可分為1～9共9個(gè)基因型，主要存在于野生水鳥、水禽以及活禽市場(chǎng)中，近年來我國大陸從水禽及活禽市場(chǎng)中也分離到了此類毒株。
　　 國內(nèi)NDV分離株的的分子流行病學(xué)分析證實(shí)我國目前同時(shí)存在Ⅰ類和Ⅱ類新城疫病毒，Ⅱ類NDV中的基因Ⅶ型毒株是引起我國NDV發(fā)生和流行的主要病原體，因此建立快速、敏感、特異性強(qiáng)的快速診斷方法對(duì)早期發(fā)現(xiàn)病原至關(guān)重要。此外，Ⅰ類NDV

3、作為新近出現(xiàn)的分離株，之前建立的各種分子檢測(cè)方法不能同時(shí)檢測(cè)兩類NDV，因此建立一種能同時(shí)檢測(cè)兩類NDV的分子診斷技術(shù)也具有重要意義。
　　 本研究通過對(duì)我國分離的13株Ⅰ類NDV分離株M基因的序列測(cè)定和一株Ⅰ類NDV代表株基因組序列測(cè)定和分析，為建立NDV通用型熒光定量RT-PCR檢測(cè)方法奠定了基礎(chǔ)。結(jié)果顯示，13株Ⅰ類NDV分離株分屬于基因2、3型，其M基因均由1241個(gè)核苷酸組成，共編碼349個(gè)氨基酸。Ⅰ類NDV代表株ND

4、V08-046的基因組長度為15198nt，具有典型的Ⅰ類NDV基因組特征，符合副粘病毒復(fù)制的“六堿基原則”。在P基因編碼區(qū)有12nt的插入。且與Ⅱ類NDV毒株不同，其HN基因編碼585個(gè)氨基酸。本研究結(jié)果為我國ClassⅠ型NDV的遺傳進(jìn)化分析提供重要依據(jù)。
　　 本研究根據(jù)測(cè)定的Ⅰ類NDV分離株M基因序列和GenBank中發(fā)表的Ⅱ類NDV代表株M基因的分子特征，選擇M基因5'高度保守的區(qū)域作為靶基因分別設(shè)計(jì)了一對(duì)引物和探針，

5、初步建立了能同時(shí)檢測(cè)Ⅰ類和Ⅱ類新城疫病毒的通用型熒光定量RT-PCR檢測(cè)方法。通過對(duì)反應(yīng)體系進(jìn)行優(yōu)化，其最低可檢測(cè)10個(gè)拷貝/uL的模板RNA，比普通RT-PCR敏感性高100倍，特異性試驗(yàn)表明僅NDV毒株能被檢出。對(duì)近年來國家新城疫參考實(shí)驗(yàn)室分離保存的64株NDV進(jìn)行檢測(cè)結(jié)果表明，所建立的方法對(duì)兩種類型的NDV有良好的適用性。
　　 本研究根據(jù)GenBank中發(fā)表的基因Ⅶ型NDV相關(guān)F基因分子特征，選擇了F基因裂解位點(diǎn)區(qū)域分別