內(nèi)源性ALV的全基因測序、J-ALV實時熒光定量PCR檢測方法的建立及應(yīng)用.pdf

1、本研究根據(jù)NCBI上ev-1設(shè)計了相應(yīng)的引物，從商品蛋雞中擴(kuò)增出一株內(nèi)源性E亞群，經(jīng)測序發(fā)現(xiàn)從正常商品蛋雞中擴(kuò)增出的ALV-E亞群序列與ev-1(E)同源性達(dá)99.1％，與SD0501(E)同源性98.9％，而與HPRS103和NX0101同源性為85.4％。與ev-3只有54.8％的同源性。
　　 本研究為研究禽白血病J亞群病毒在雞體內(nèi)各個器官的病毒分布，建立了熒光定量PCR檢測方法。根據(jù)禽白血病病毒J亞群NX0101毒株基因

2、5257-5510bp的堿基序列，設(shè)計了1對特異性引物，進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)，擴(kuò)增產(chǎn)物為253bp，同時按照參考文獻(xiàn)，合成1對β-actinPCR引物作為內(nèi)參，進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)，擴(kuò)增產(chǎn)物為139bp。將ALV-Jenv基因和β-actin擴(kuò)增產(chǎn)物與PMD-18-T載體重組，構(gòu)建的重組質(zhì)粒分別命名為PMD-18-J和PMD-18-β，測序成功后作為Real-timePCR反應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)模板。利用上述引物和SYBRGreenⅠ染料進(jìn)行Rea

3、l-timePCR反應(yīng)，建立了標(biāo)準(zhǔn)曲線，并進(jìn)行反應(yīng)靈敏性、特異性和重復(fù)性試驗。試驗結(jié)果表明：標(biāo)準(zhǔn)曲線線性關(guān)系R值均為0.9914，檢測極限約為100拷貝質(zhì)粒DNA；特異性分析表明只有禽白血病病毒能檢測到特異性的熔解度峰值；批內(nèi)和批間重復(fù)性試驗的變異系數(shù)均小于5％。本研究所建立的ALV-J基因?qū)崟r熒光定量RT-PCR方法靈敏度高、特異性強(qiáng)、檢測周期短，為研究禽白血病J亞群病毒在畜禽體內(nèi)各個器官的病毒分布奠定了基礎(chǔ)。
　　 然后用已

4、建立的實時熒光定量RT-PCR方法對人工感染ALV-J后8周齡的SPF雞心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、胸腺、法氏囊、腺胃分別提取RNA反轉(zhuǎn)錄成CDNA后進(jìn)行熒光定量PCR的檢測。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線公式計算出J基因和β-actin的拷貝數(shù)，然后根據(jù)公式：ALV-J相對表達(dá)量=ALV-J拷貝數(shù)/β-actin拷貝數(shù)計算ALV-J的相對含量。通過比較數(shù)值得出可以得出法氏囊中ALV-J基因的相對含量最高，脾臟和胸腺次之，肝臟和腺胃第三，兩者之間也無差

5、異，心臟含量最低。針對實驗室送診ALV病例，采用上述方法對各個器官進(jìn)行熒光定量PCR檢測，具有血管瘤癥狀自然感染雞只的胸腺中ALV-J的相對含量最高，其他器官依次是法氏囊>腎臟>腺胃>脾臟>肝臟>肺臟，心臟含量最低。此雞只的器官與實驗組人工感染的SPF雞比較，腎臟和胸腺的含量高于SPF雞，其余器官都低于SPF雞。另外肝臟有肉眼可見腫瘤結(jié)節(jié)的自然感染雞中肝臟的ALV-J基因的相對含量最高；胸腺、法氏囊、脾臟次之，但是三者之間無差異性；腎臟