傳染性法氏囊病病毒VP2與C3d串聯(lián)基因重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建及其免疫功能分析.pdf

1、傳染性法氏囊病(Infectious Bursal Disease，IBD)是由傳染性法氏囊病病毒(Infectious Bursal Disease Virus，IBDV)引起的起的雞的一種高度接觸性傳染病，以侵害雛雞法氏囊損傷為主要特征的傳染病。雞孵出后3-6周，法氏囊發(fā)育成熟，此時是IBDV的易感期。雞感染IBDV后，機(jī)體出現(xiàn)免疫抑制，IBDV在法氏囊的B淋巴細(xì)胞中繁殖同時損傷B淋巴細(xì)胞，導(dǎo)致疫苗免疫接種失敗和繼發(fā)感染的發(fā)生，造成

2、動物死亡。預(yù)防該病最有效的方法是接種疫苗，但是毒株的變異和強(qiáng)毒株的出現(xiàn)造成免疫失敗。目前，針對IBD的疫苗有活疫苗和滅活疫苗，前者因不同IBDV毒株之間潛在著基因重配的可能，使其存在著較大的生物安全問題，給該病的防控帶來隱患;而滅活疫苗有制備困難以及免疫效果低下等問題。因此，此病仍然流行，對養(yǎng)雞業(yè)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。為此，當(dāng)前禽病防控工作中亟待解決的重要課題為研制新型IBDV基因工程疫苗，提高免疫效力。本研究內(nèi)容包括以下三個部分:

3、>　　 試驗(yàn)1:傳染性法氏囊病病毒VP2與C3d串聯(lián)基因重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建及其在真核細(xì)胞中的表達(dá)為了提高傳染性法氏囊病病毒(IBDV)VP2基因核酸疫苗的免疫效力，根據(jù)已發(fā)表的雞源C3d序列，設(shè)計在5'端添加連接肽(Gly4Ser)2序列的C3d基因，合成并克隆到pUC57載體中。用同尾酶BglⅡ和BamHⅠ構(gòu)建含有1～3拷貝C3d的重組表達(dá)質(zhì)粒pcDNA-C3d、pcDNA-2C3d、pcDNA-3C3d，將IBDV VP2基因定向

4、插入到1～3拷貝C3d基因的3'端，獲得含VP2與1～3拷貝C3d串聯(lián)基因的重組真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA-VP2-C3d、pcDNA-VP2-2C3d、pcDNA-VP2-3C3d。將3種質(zhì)粒用脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染BHK21細(xì)胞，間接免疫熒光試驗(yàn)(IFA)檢測，均具有特異性熒光，用蛋白免疫印跡(Western blot)分析，pcDNA-VP2-C3d轉(zhuǎn)染后出現(xiàn)一條分子量約84ku的蛋白帶，與VP2-C3d重組蛋白的分子量理論值相符合;pcDNA

5、-VP2-2C3d轉(zhuǎn)染后出現(xiàn)一條分子量約124 ku的蛋白帶，與VP2-2C3d重組蛋白的分子量理論值相符合;pcDNA-VP2-3C3d轉(zhuǎn)染后出現(xiàn)一條分子量約162 ku的蛋白帶;與VP2-3C3d重組蛋白的分子量理論值相符合，表明VP2與含有不同拷貝C3d的重組表達(dá)質(zhì)粒均能夠并在真核細(xì)胞中正確表達(dá)，為研制以雞補(bǔ)體C3d為分子佐劑的免疫增強(qiáng)型IBD VP2基因核酸疫苗奠定了基礎(chǔ)。
　　 試驗(yàn)2:分子佐劑C3d對雞傳染性法氏囊病

6、病毒VP2核酸疫苗的免疫功能的影響為了研究不同拷貝分子佐劑C3d對IBD VP2基因免疫功能的影響，本實(shí)驗(yàn)將pcDNA-VP2、pcDNA-VP2-C3d、pcDNA-VP2-2C3d、pcDNA-VP2-3C3d與空載體分別免疫SPF雞，14日齡首免，免疫兩次，間隔兩周，二免后14 d用IBDV標(biāo)準(zhǔn)強(qiáng)毒株BC6/85攻擊.二免后14 d，ELISA方法測其抗體效價，pcDNA-VP2-3C3d、pcDNA-VP2-2C3d誘導(dǎo)的抗體水

7、平顯著高于pcDNA-VP2組;中和試驗(yàn)檢測抗IBDV血清中和效價，pcDNA-VP2-3C3d組效價顯著高于pcDNA-VP2組，pcDNA-VP2-C3d、pcDNA-VP2-2C3d組效價高于pcDNA-VP2組差異不顯著;硫氰酸鹽洗脫法檢測抗體親爭力水平，pcDNA-VP2-3C3d的抗體親和力指數(shù)為高于pcDNA-VP2、pcDNA-VP2-C3d、pcDNA-VP2-2C3d誘導(dǎo)的抗體親和力;MTT法檢測淋巴細(xì)胞增殖水平，p

8、cDNA-VP2-3C3d誘導(dǎo)的刺激指數(shù)顯著高于pcDNA-VP2組，pcDNA-VP2-C3d、pcDNA-VP2-2C3d誘導(dǎo)的刺激指數(shù)高于pcDNA-VP2組，但差異不顯著(p＜0.05）。攻毒后4，5d出現(xiàn)死亡，攻毒空質(zhì)粒及空白對照雞全部發(fā)病死亡。pcDNA-VP2-3C3d、pcDNA-VP2-2C3d、pcDNA-VP2-C3d、pcDNA-VP2組的免疫保護(hù)率分別為70.0％，63.33％，56.67％，46.67％。pc

9、DNA-VP2-3C3d、pcDNA-VP2-3C3d組的免疫保護(hù)率顯著高于pcDNA-VP2組，pcDNA-VP2-2C3d、pcDNA-VP2-C3d組的免疫保護(hù)率均高于pcDNA-VP2組差異不顯著(p＜0.05）。結(jié)果說明，分子佐劑C3d提高了VP2基因疫苗誘導(dǎo)的抗體水平，加速了抗體親和力成熟，促進(jìn)細(xì)胞免疫的增強(qiáng)，并可部分抵抗IBDV強(qiáng)毒BC6/85的攻擊。1～3拷貝的C3d均可不同程度地增加VP2基因核酸疫苗的免疫效果，其中3

10、拷貝分子佐劑C3d的免疫增強(qiáng)能力最顯著。
　　 試驗(yàn)3:聚乙烯亞胺介導(dǎo)的pcDNA-VP2-3C3d重組真核表達(dá)質(zhì)粒免疫效果聚乙烯亞胺(polyethylenimine，PEI)是一種新型陽離子多聚物基因釋放載體，可結(jié)合濃縮DNA，通過粘附內(nèi)吞，進(jìn)入細(xì)胞，使攜帶的質(zhì)粒表達(dá)。為了進(jìn)一步提高pcDNA-VP2-3C3d的免疫效果，pcDNA-VP2-3C3d與PEI分別按4、6、8、10的NH4+/PO3-比(N/P)混合，命名為V

11、P2-3C3d-4、VP2-3C3d-6、VP2-3C3d-8、 VP2-3C3d-10免疫組，分別免疫SPF雞，免疫兩次。二免后14 d用IBDV標(biāo)準(zhǔn)強(qiáng)毒株BC6/85攻擊。ELISA方法測其抗體效價，二免后14d，VP2-3C3d-4免疫組的特異性抗IBDV水平與pcDNA-VP2-3C3d組相同;N/P值為6和8的免疫組的抗體效價顯著高于pcDNA-VP2-3C3d組;N/P值為10的抗體效價低于pcDNA-VP2-3C3d組(p

12、＜0.05）。中和試驗(yàn)檢測中和效價，結(jié)果與ELISA方法測得結(jié)果一致。二免后14d用IBDV標(biāo)準(zhǔn)強(qiáng)毒株BC6/85攻擊，VP2-3C3d-4、VP2-3C3d-6、VP2-3C3d-8、VP2-3C3d-10、pcDNA-VP2-3C3d組存活率分別達(dá)到66.67％、90.00％、93.33％、60.00％、77.33％，VP2-3C3d-6、VP2-3C3d-8組存活率顯著高于pcDNA-VP2-3C3d組(p＜0.05）。攻毒空質(zhì)粒