雞傳染性法氏囊病病毒JS株VP2蛋白重組腺病毒的構(gòu)建及其免疫特性.pdf

1、雞傳染性法氏囊病(Infectious bursal disease，IBD)是由雞傳染性法氏囊病病毒(Infectious bursal diseasevirus，IBDV)引起的雞的主要傳染性疾病之一，已造成世界養(yǎng)雞業(yè)的巨大經(jīng)濟(jì)損失。該病主要侵害3-12周齡的雛雞與青年雞的法氏囊器官，導(dǎo)致不同程度的免疫抑制，從而增加宿主對并發(fā)和繼發(fā)性病毒或細(xì)菌感染的易感性。VP2蛋白是IBDV的主要結(jié)構(gòu)性蛋白，具有良好的抗原性，并且在宿主體內(nèi)可誘導(dǎo)

2、產(chǎn)生中和抗體，因此VP2基因是研究IBDV疫苗的重要目的基因。
　　 根據(jù)GeneBank已發(fā)表的VP2(Accession No.M64285)基因序列合成一對引物，用RT-PCR技術(shù)從IBDVJS株擴(kuò)增出VP2基因，并克隆入pGEM-TEasy載體。序列分析結(jié)果表明，IBDVJS株氨基酸序列與各超強(qiáng)毒株的同源性達(dá)到94.8％以上。將VP2基因插入到真核表達(dá)載體pcDNA3.1/zeo(-)中構(gòu)建真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1-

3、VP2，并轉(zhuǎn)染進(jìn)入HEK-293細(xì)胞進(jìn)行暫態(tài)表達(dá)。48h后用間接免疫熒光技術(shù)可檢測到VP2蛋白在H3K-293細(xì)胞胞漿中成功表達(dá)，證明該VP2片段具有良好的抗原性，可作為研制IBDV重組腺病毒工程疫苗的目的基因。
　　 將VP2基因插入到穿梭載體pShuttle-CMV中，構(gòu)建重組穿梭質(zhì)粒pShuttle-CMV-VP2。線性化的重組穿梭質(zhì)粒轉(zhuǎn)化BJ5183感受態(tài)細(xì)胞，與腺病毒骨架質(zhì)粒pAdEasy-1進(jìn)行菌內(nèi)同源重組，得到重組

4、質(zhì)粒rAd-VP2。用線性化的rAd-VP2轉(zhuǎn)染HEK-293細(xì)胞，篩選得到表達(dá)VP2的重組腺病毒。噬斑純化后的重組病毒在HEK-293細(xì)胞上傳至第5代，其病毒滴度為107.8/mLTCID50。PCR方法分析結(jié)果進(jìn)一步證實，重組病毒含有VP2基因，可以檢測出特異目的條帶并且測序完全正確；用抗IBDV特異性單克隆抗體進(jìn)行IFA研究證明，感染重組病毒的細(xì)胞呈現(xiàn)亮綠色熒光，提示IBDVVP2在細(xì)胞中獲得表達(dá)；Western-blot分析結(jié)果